New England Biolabs, M6630L, mezcla de reparación de ADN FFPE NEBNext®

Para un rendimiento superior, el módulo NEBNext FFPE DNA Repair v2 ( Categorías relacionadas ADN FFPE, Especificaciones de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados Reactivos para la construcción de bibliotecas (p. ej., kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext Ultra II para Illumina (NEB n.º E7645)) Agua libre de nucleasas con etanol al 100 % Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 o tubos TE DNA LoBind 0,1X (Eppendorf n.º 022431021) Perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) Oligonucleótidos multiplex NEBNext para Illumina Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.º S1515S), placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Preguntas frecuentes sobre la máquina PCR P: ¿La mezcla de reparación de ADN FFPE ligará mi ADN? ¿Fragmentos? R: La ligasa presente en la mezcla reparadora de ADN FFPE es la Taq ADN ligasa (NEB n.° M0208). Esta ligasa sella eficazmente las mellas en el ADN, pero no es eficaz para ligar fragmentos en un desajuste ni para ligar ADN con extremos romos. De hecho, nunca hemos observado que esta enzima ligue ADN con extremos romos. P: ¿Tratar mi ADN con la mezcla reparadora de ADN FFPE perjudicará mi reacción posterior? R: No. No hemos observado que la mezcla reparadora de ADN FFPE tenga un efecto negativo en la mayoría de las aplicaciones posteriores. La mezcla reparadora solo actúa sobre bases dañadas, mellas y huecos. Sin embargo, en aplicaciones especializadas, como la detección de metilación en muestras dañadas, existe la posibilidad de que la zona de bases rellenada durante la función de traducción de la mella de la reparación pueda borrar las firmas de metilación. Este efecto es más pronunciado en experimentos con bajo aporte de ADN. P: ¿La mezcla reparadora de ADN FFPE romará los extremos del ADN? R: No. La polimerasa presente en la mezcla reparadora de ADN FFPE, Bst DNA La polimerasa rellenará los salientes 5', pero no eliminará los salientes 3'. Además, esta polimerasa añadirá un dA al saliente 5' rellenado. P: ¿La mezcla de reparación de ADN FFPE inserta nucleótidos aleatorios en la secuencia que repara? R: No, la polimerasa de la mezcla añade las bases complementarias que corresponden a la plantilla. La mezcla de reparación no introducirá artefactos en la secuencia. P: ¿La mezcla de reparación de ADN FFPE elimina modificaciones covalentes de las bases de ADN, como la metilación, la biotina o la digoxigenina? R: No, esta mezcla de reparación no eliminará específicamente las modificaciones covalentes en las bases de ADN; sin embargo, las bases adyacentes a los sitios dañados pueden reemplazarse con bases no modificadas durante el proceso de reparación. P: ¿La mezcla de reparación de ADN FFPE repara los enlaces cruzados ADN-proteína? R: No, la mezcla de reparación no repara los enlaces cruzados ADN-proteína. P: ¿La mezcla de reparación de ADN FFPE repara los extremos 3' bloqueados? R: Sí, la mezcla de reparación pule el extremo 3' a un hidroxilo si hay un bloqueo en el extremo 3'. P: ¿Puede la mezcla reparadora de ADN FFPE reparar daños tanto en ADN monocatenario como bicatenario? ¿O requiere ADN bicatenario como plantilla? R: La mezcla reparadora de ADN FFPE se utiliza con ADN bicatenario. Algunas de las enzimas reparadoras de ADN que contiene la mezcla pueden reconocer daños en el ADN monocatenario, pero los pasos de polimerización y ligadura requieren ADN bicatenario. P: Si tuviera una plantilla de ADN con sitios de mutación (p. ej., 8-oxoguanina o citosinas deaminadas) directamente adyacentes en cadenas opuestas, ¿el tratamiento con la mezcla reparadora de ADN FFPE causaría una muesca o rotura en la doble cadena? R: No hemos probado la reparación de sitios de mutación adyacentes en cadenas opuestas. En este caso, si las dos bases dañadas se eliminan al mismo tiempo, podría producirse una rotura en la doble cadena, lo que resultaría en ADN fragmentado. Si, por otro lado, una reacción es más rápida que la otra y no ocurren simultáneamente, la mezcla reparadora de ADN FFPE debería... Repararlos. P: ¿Qué longitudes de gap se pueden reparar con la mezcla reparadora de ADN FFPE? R: Se desconoce la longitud exacta del gap. Según nuestra experiencia, es de entre 5 y 10 nucleótidos. P: Al trabajar con ADN fragmentado, ¿la mezcla de reacción de la mezcla reparadora de ADN FFPE unirá los extremos? R: No, la Taq ADN ligasa de la mezcla solo se unirá donde haya una muesca en el ADN bicatenario (dsDNA). P: ¿Cómo se reparan los sitios abásicos con la mezcla de reacción de la mezcla reparadora de ADN FFPE? R: En el caso del ADN bicatenario, la mezcla reparadora reconoce el sitio abásico y corta la cadena principal del ADN. La polimerasa reemplaza la base faltante con la base correcta y la ligasa liga el ADN. P: ¿Puedo usar la mezcla reparadora de ADN FFPE para reparar otros tipos de ADN de baja calidad que no sean FFPE? R: Sí. La mezcla reparadora reparará muchos daños básicos en el ADN que se encuentran comúnmente en otros tipos de ADN de baja calidad, como el ADN dañado por rayos UV. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEBNext? ¿Módulo de Reparación de ADN FFPE v2 (NEB n.° E7360) y Mezcla de Reparación de ADN FFPE NEBNext (NEB n.° M6630)? R: El Módulo de Reparación de ADN FFPE NEBNext v2 incluye las mismas actividades de reparación que la Mezcla de Reparación de ADN FFPE NEBNext, pero se ha optimizado para una mayor eficiencia de reparación, un flujo de trabajo más ágil con la preparación de la biblioteca NEBNext y un tampón de reacción más práctico que contiene todos los componentes necesarios para una reparación eficiente del ADN, así como para la reparación de los extremos posteriores y la eliminación de dA.