New England Biolabs, M7634L, NEBNext UltraShear®

La fragmentación enzimática del ADN, como parte del proceso de preparación de bibliotecas, ofrece numerosas ventajas en comparación con el cizallamiento mecánico. Sin embargo, se requieren reactivos de fragmentación especializados para el cizallamiento enzimático a fin de mantener las marcas de metilación en las muestras para el análisis del metiloma o para su uso con muestras complejas, como el ADN FFPE. Categorías relacionadas Fragmentación de ADN y fragmentación de ARN, ADN FFPE, secuenciación de próxima generación Especificación de preparación de bibliotecas Materiales necesarios pero no suministrados 1X TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) Tubos de PCR de pared fina de 0,2 ml Soporte/gradilla magnéticos (NEB n.º S1515S; Alpaqua® n.º A001322 o equivalente) Máquina de PCR Microcentrífuga Vortex Bioanalyzer®, TapeStation® u otro analizador de fragmentos y consumibles asociados Etanol al 80 % Para usar con el protocolo NEBNext UltraShear: se recomienda el kit de reactivos SPRIselect™ (Beckman Coulter, Inc. n.º B23317), las perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) o el kit de limpieza de ADN y PCR Monarch®® (NEB n.º T1030S/L) para la Sección 1. Para usar con el extremo NEBNext Ultra II Protocolo del módulo de reparación/cola de dA: Módulo de reparación de extremos/cola de dA NEBNext Ultra II (NEB n.° E7546S/L) para la sección 2. Material no incluido: Módulo de ligadura NEBNext Ultra II (NEB n.° E7595) y oligos multiplex NEBNext (www.neb.com/oligos). Para usar con el protocolo de metil-seq enzimático NEBNext: Kit de metil-seq enzimático NEBNext (NEB n.° E7120S/L) para la sección 3. Formamida (Sigma n.° F9037 - 100 ml) o NaOH 0,1 N opcional. Se prefiere la formamida. Si usa NaOH, consulte las preguntas frecuentes del kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq (NEB n.º E7120). Preguntas frecuentes sobre productos sin nucleasas P: ¿NEBNext UltraShear™ es lo mismo que NEBNext® Ultra™ II FS o NEBNext dsDNA Fragmentase®? R: No. Estos reactivos de fragmentación enzimática no contienen las mismas enzimas. NEBNext UltraShear se ha diseñado para muestras difíciles, incluido el ADN FFPE, y para el análisis del metiloma. NEBNext Ultra II FS es nuestra recomendación para la preparación estándar de bibliotecas de ADN para la secuenciación de Illumina® y tiene un flujo de trabajo más optimizado. NEBNext dsDNA Fragmentase es nuestro producto heredado para la fragmentación de ADN basada en enzimas. P: ¿Realmente necesita agitar NEBNext UltraShear™? R: Sí, si no agitar NEBNext UltraShear, los resultados pueden variar. P: Para los flujos de trabajo de EM-seq™, ¿cuáles son las recomendaciones para fragmentar ADN ya fragmentado, ADN de baja integridad o ADN FFPE con NEBNext UltraShear™? R: Si se trabaja con ADN ya fragmentado, de baja integridad o ADN FFPE antes de la preparación de la biblioteca de EM-seq (Sección 5 del manual de NEBNext UltraShear), para el paso 5.1.6. sugerimos fragmentar con NEBNext UltraShear durante menos tiempo (5-15 minutos a 37 °C; podría ser necesario optimizar el proceso). Además, sugerimos realizar limpiezas de microesferas de purificación de muestras a 0,9X después de la desaminación de citosinas (Paso 5.9.2.) y después de la amplificación por PCR (Paso 5.11.3). Tenga en cuenta que no recomendamos una limpieza rigurosa de microesferas de purificación de muestras (p. ej., 0,65X) para muestras de ADN ya fragmentadas, de baja integridad o ADN FFPE. P: Tras la fragmentación del protocolo NEBNext UltraShear™, ¿se pueden almacenar las reacciones a -20 ˚C? R: Sí, tras la fragmentación con NEBNext UltraShear, las reacciones se pueden almacenar durante la noche a -20 ˚C. P: ¿Recomiendan NEBNext UltraShear™ para la preparación de bibliotecas de ADN con alta sensibilidad y baja tasa de error? R: Se ha informado que el uso de NEBNext UltraShear para la fragmentación ofrece alta sensibilidad y baja tasa de error en comparación con otros métodos de fragmentación enzimática y cizallamiento mecánico (p. ej., Covaris®), antes de la preparación de la biblioteca de ADN. Sin embargo, no disponemos de datos internos para esta aplicación. P: ¿Puedo fragmentar mi muestra de ADNg con NEBNext UltraShear® en tampones distintos a 1X TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA)? R: Las muestras de ADNg pueden fragmentarse con NEBNext UltraShear® con los tampones de elución habituales en los kits de extracción de ADNg, como el tampón de elución de ADN Monarch®, el tampón de elución de ADNg Monarch®, el tampón de elución de ADNg Monarch® II, el tampón EB y el tampón AE, en lugar de TE 1X pH 8,0. Sin embargo, la fragmentación con NEBNext UltraShear es más lenta con las muestras de ADNg fragmentadas en estos tampones de elución. Es necesario optimizar las condiciones de fragmentación y podría ser necesario incubarla durante periodos más prolongados a 37 °C o 45 °C, en comparación con las muestras de ADNg en TE 1X pH 8,0. Tampón de elución de ADN Monarch® (NEB n.º T1016): 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA pH 8,5 Tampón de elución de ADNg Monarch® (NEB n.º T3016): 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA pH 9,0 Tampón de elución de ADNg Monarch® II (NEB n.º T3056) o tampón AE: 10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA pH 9,0 Tampón EB de Qiagen: 10 mM Tris-HCl pH 8,5 P: Si la fragmentación a 37 ˚C tarda mucho tiempo (30 minutos o más), ¿hay alguna forma de acelerar mi fragmentación NEBNext UltraShear? R: Si no se logra el perfil de fragmentación deseado tras una incubación prolongada a 37 °C, para acelerar la fragmentación, se puede incubar la reacción NEBNext UltraShear a 45 °C en lugar de 37 °C. No se recomienda iniciar la optimización a 45 °C, ya que la mayoría de las muestras se fragmentan a 37 °C. Usar la temperatura más alta inmediatamente puede sobrefragmentar el ADN. Recomendamos probar y optimizar estas condiciones según el tipo de muestra y la aplicación específicos.