New England Biolabs, M7635S, ADNasa dúplex

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas Aplicaciones Síntesis de ADNc Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 3 pmol de FAM a partir de un oligonucleótido de horquilla marcado con FAM-BHQ1 de 35 meros en 1 minuto a 30 °C en un volumen de reacción de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r2.1 1X NEBuffer™ r2.1 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂ 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Concentración de uso 2000 unidades/ml Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación térmica 75 °C durante 10 minutos en presencia de 1 mM DTT. Si la muestra contiene ARN, recomendamos añadir EDTA (concentración final de 10 mM) y DTT (concentración final de 1 mM) antes de la inactivación térmica. El ARN puede degradarse a temperaturas superiores a 65 °C en presencia de metales divalentes como el Mg₂. Preguntas frecuentes P: ¿Se puede inactivar térmicamente la Duplex DNase? R: La DNasa Duplex se puede inactivar por calor añadiendo DTT u otro agente reductor (concentración final de 1 mM) a una reacción de DNasa Duplex e incubando a 75 °C durante 10 minutos. Si la muestra contiene ARN, recomendamos añadir EDTA (concentración final de 10 mM) junto con DTT (concentración final de 1 mM) antes de la inactivación por calor, ya que las temperaturas superiores a 65 °C en presencia de metales divalentes como el Mg₂₄ pueden degradar el ARN. P: ¿La sal inhibe la DNasa Duplex? R: La DNasa Duplex se inhibe aumentando la cantidad de sal. Recomendamos mantener la concentración de sal por debajo de 50 mM (concentración final) en la reacción de DNasa Duplex. La actividad de la DNasa Duplex se inhibe al aumentar la concentración de sal. La actividad de la DNasa Duplex se midió monitorizando el aumento de la fluorescencia al escindir un sustrato de ADN bicatenario en horquilla de 35 nt extinguido en tampón de reacción 1X (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, MgCl₂ 2,5 mM, CaCl₂ 0,5 mM) con una concentración de sal creciente, como se indica. P: ¿A qué temperatura debo usar la DNasa Duplex? R: La DNasa Duplex es activa en un amplio rango de temperaturas (25-65 °C). La temperatura óptima de reacción varía y puede que deba determinarse empíricamente según las condiciones de reacción. La ADNasa dúplex degrada preferentemente el ADNbc en una mezcla de ADNbc y ADNmc en un amplio rango de temperaturas Una mezcla de 20 pmol de ADNbc (oligonucleótido de 60 pb) y 20 pmol de ADNmc (oligonucleótido de 50 nt) se incubó con 2 unidades de ADNasa dúplex durante 1 minuto a 25 °C, 37 °C, 50 °C o 65 °C y luego se corrió en un gel E-gel™ EX al 4 % (Thermo Fisher Scientific®) teñido con SYBR® Gold. Carril 1: marcador de PCR de ADNbc (NEB n.º N3234), Carril 2: ADNmc 50 nt, Carril 3: ADNbc 60 pb, Carriles 4-7: 25 °C, 37 °C, 50 °C, 65 °C. La ADNasa dúplex muestra una mayor actividad y preferencia por el ADN bicatenario con temperaturas crecientes. FLUOR = Fluoróforo P: ¿Cuál es la longitud mínima de ADN dúplex requerida para que la ADNasa dúplex lo escinda? R: La ADNasa dúplex requiere al menos 9-10 pb de ADN dúplex para la escisión. P: ¿La ADNasa dúplex requiere cationes divalentes? R: Sí, la ADNasa dúplex requiere la presencia de cationes divalentes, específicamente Mg2+. No recomendamos usar la ADNasa dúplex en presencia de calcio (Ca2+) ya que esto aumentará la promiscuidad de la enzima (actividad hacia el ADNmc). P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción óptimas para la ADNasa dúplex? R: La ADNasa dúplex es más activa en reacciones realizadas a pH 7,0, que contienen menos de 50 mM de sal y un catión divalente de Mg2+ (no Ca2+). La DNasa dúplex es activa en un amplio rango de temperaturas (25-65 °C) y requiere al menos 9-10 pb de ADN dúplex para su escisión. P: ¿Cómo se compara la definición de unidad de la DNasa dúplex con la de otras DNasas específicas para dúplex? R: Aunque la actividad de la DNasa dúplex no se mide utilizando la definición clásica de unidad de Kunitz, estimamos que, al igual que con otras DNasas específicas para dúplex, su actividad específica es de 200 000 U/mg.