New England Biolabs, M9204L, ADN polimerasa Bst-XT WarmStart™

¿Necesitas ayuda para diseñar cebadores LAMP? Usa las Categorías Relacionadas Amplificación isotérmica y desplazamiento de hebra Aplicaciones Amplificación isotérmica mediada por bucle,, Amplificación isotérmica,, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Especificación Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 100 mM KCl 0,5 mM TCEP 0,1 mM EDTA Estabilizadores 1X Glicerol al 50% pH 7,5 Preguntas frecuentes P: ¿Puede la ADN polimerasa Bst-XT inactivarse por calor? R: Sí, calentar a 80 °C durante 20 minutos. P: ¿Puede usarse la ADN polimerasa Bst-XT a temperaturas distintas de 65 °C para reacciones LAMP? R: Sí, la Bst-XT puede usarse para realizar reacciones LAMP en un amplio rango de temperaturas (50 °C - 70 °C). El rendimiento óptimo puede variar entre amplicones/conjuntos de cebadores, por lo que las temperaturas de cribado pueden ser beneficiosas. No se recomienda el uso de Bst-XT a temperaturas superiores a 72 °C. P: ¿Se puede diluir la ADN polimerasa Bst-XT? R: Sí. La Bst-XT se puede diluir justo antes de su uso. Al diluir el producto Bst-XT sin glicerol de 120 000 U/ml con tampón de amplificación isotérmica Bst-XT 1X (hasta 8000 U/ml), la Bst-XT diluida se puede almacenar a 4 °C hasta 7 días. P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst-XT en la detección colorimétrica de punto final? R: Sí, la Bst-XT se puede utilizar en la detección colorimétrica de punto final utilizando colorantes indicadores de metales no basados ​​en pH, incluido el azul de hidroxinaftol (HNB). Recomendamos añadir 120 µM de HNB a 25 µL de la reacción LAMP/RT-LAMP. Al usar HNB, la concentración final de MgSO₄ puede aumentarse hasta 8 mM para mejorar el contraste de color entre las muestras positivas y negativas. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst-XT con otros tampones NEB? R: Se obtendrá un rendimiento óptimo utilizando el tampón de amplificación isotérmica Bst-XT (NEB n.° B9250) a 1X y 6 mM de MgSO₄. Sin embargo, la Bst-XT puede usarse correctamente con el tampón de amplificación isotérmica (NEB n.° B0537) y 6 mM de MgSO₄, aunque probablemente se observará un retraso en el tiempo de detección. No recomendamos usar el tampón de amplificación isotérmica II (NEB n.° B0374) ni el tampón ThermoPol® (NEB n.° B9004) con la ADN polimerasa Bst-XT, ya que el rendimiento se reduce considerablemente. P: ¿Cómo puedo optimizar las reacciones LAMP/RT-LAMP para dianas difíciles al usar Bst-XT? A: Para objetivos desafiantes y/o de bajo número de copias, se pueden modificar las siguientes condiciones de reacción: El tiempo de reacción se puede aumentar hasta 40 minutos La concentración de enzima se puede aumentar hasta 600 U/ml La concentración final de MgSO4 se puede optimizar (normalmente 6-8 mM) P: ¿Cómo uso UDG termolábil antártico para la prevención del arrastre en reacciones LAMP? R: La prevención de la contaminación por arrastre requiere dos partes: la incorporación de dUTP por una ADN polimerasa durante la generación del amplicón y la escisión de esos uracilos en los productos amplificados y la destrucción del amplicón catalizada por una UDG. Para LAMP, las reacciones se deben realizar con una inclusión de ~50% de dUTP mezclado con dTTP (por ejemplo, 1,4 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,7 mM de dTTP y dUTP) y se debe utilizar una ADN polimerasa Bst para la incorporación eficiente de dU sin una inhibición significativa de la reacción. Para la posterior destrucción de productos contaminantes, se recomienda encarecidamente el UDG termolábil antártico en lugar del UDG de E. coli más termoestable. Incluya 0,5 μL de UDG termolábil antártico por cada 25 μL de reacción LAMP y simplemente configure y ejecute sus reacciones LAMP de forma normal. La actividad de UDG durante la configuración y el calentamiento a 65 °C destruirá de forma rápida y eficiente cualquier producto contaminante. Si se requiere una descontaminación más rigurosa, se pueden agregar 10 minutos a 25 °C al comienzo del flujo de trabajo. Para simplificar, dUTP y UDG se han incluido en una actualización: WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix con UDG y kit LAMP fluorescente WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (con UDG). P: ¿Qué es LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipo sofisticado. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP funcionando como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Cuál es la diferencia entre la ADN polimerasa Bst, Fragmento Grande, Bst 2.0, Bst 3.0 y la ADN polimerasa Bst-XT? R: Las cuatro polimerasas son ADN polimerasas moderadamente termoestables con actividad de desplazamiento de cadena, lo que les permite realizar reacciones de amplificación isotérmica como LAMP. La ADN polimerasa Bst 2.0 es un homólogo diseñado in silico de la ADN polimerasa Bst, Fragmento Grande. Está diseñada para mejorar las propiedades en las reacciones LAMP, incluyendo la tolerancia a la sal, la termoestabilidad y la incorporación de dUTP. La Bst 2.0 destaca por su alta especificidad. La Bst 3.0 ofrece algunas mejoras, entre las que destaca una mayor velocidad de amplificación. La Bst 3.0 también ha mejorado su rendimiento en reacciones LAMP a temperaturas más altas (hasta 72 °C); sin embargo, para algunos objetivos, la Bst 3.0 no conserva la alta especificidad de la Bst 2.0. Bst-XT combina las propiedades más deseables de Bst 2.0 y Bst 3.0. Ofrece la alta especificidad de Bst 2.0 y la rápida velocidad de amplificación de Bst 3.0. Bst-XT también es activo en un rango de temperatura más amplio, lo que permite reacciones LAMP entre 50 y 70 °C. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 Velocidad de amplificación ★★★★★ ★★★★ ★★★★★ Especificidad ★★★★★ ★★★★★ ★★ ¿Configuración a temperatura ambiente? Habilitado Habilitado No recomendado Temperatura óptima de LAMP 50-70 °C 60-70 °C 55-72 °C Disponible sin glicerol Sí NEB #M9205 Sí NEB #M0402 Sí NEB #M0443 ★★★★★ = producto óptimo recomendado para la aplicación seleccionada ★★ o ★★★ = funcionará en la aplicación seleccionada ★ = puede funcionar pero no se recomienda P: ¿Cuál es la concentración recomendada de Mg+2 para usar con Bst-XT en reacciones LAMP? R: Recomendamos usar un total de 6 mM de MgSO4 en reacciones LAMP y RT-LAMP con Bst-XT. El tampón de amplificación isotérmica Bst-XT contiene 2 mM de MgSO₄ a 1X, por lo que se recomienda complementarlo con 4 mM de MgSO₄ adicionales utilizando el MgSO₄ de 100 mM (NEB n.° B1003) proporcionado. Si se requiere una mayor optimización, el MgSO₄ final puede aumentarse hasta un total de 8 mM.