New England Biolabs, N0378S, vector pMAL-c6T

El vector pMAL-c6T está diseñado para producir fusiones de proteína de unión a maltosa (MBP) en el citoplasma. La MBP ha sido diseñada para una unión más estrecha a la resina de amilosa. El vector expresa una proteína marcada con his en el extremo N-terminal. Categorías relacionadas Sistema de fusión y purificación de MBP NEBExpress, Expresión de proteínas bacterianas de E. coli, Plásmidos y sustratos de ADN, Aplicaciones Insolubilidad de la proteína diana, Expresión no T7, Expresión de proteínas difíciles, Etiqueta de afinidad de especificación Archivos de secuencia de proteína de unión a maltosa (MBP) Preguntas frecuentes de Fasta GenBank P: ¿Qué cepa(s) recomiendan como hospedadoras para los vectores pMAL? R: Recomendamos NEBExpress Competent E. coli (NEB #C2523). Esta es una cepa de E. coli B similar a T7 Express y BL21 (DE3), excepto que carece de la ARN polimerasa T7 (los vectores pMAL utilizan la ARN polimerasa de E. coli). NEB Express, T7 Express (NEB #C2566), BL21 (NEB #C2530) y BL21(DE3) (NEB #C2527) E. coli competentes dan resultados similares: la presencia de la ARN polimerasa T7 no parece tener ningún efecto. Otras cepas exitosas incluyen NEB 10-beta (NEB #C3019) y NEB Turbo (NEB #C2984) E. coli competentes. Uno puede comenzar con NEB Express, o con cualquier célula competente que esté fácilmente disponible, y luego probar con otra cepa si se desarrolla un problema con la expresión o purificación. P: ¿Qué cebadores debo usar para secuenciar los extremos de mi inserto después de clonarlo en un vector pMAL? R: Se pueden usar los siguientes cebadores de secuenciación (no disponibles en New England Biolabs): cebador malE en el lado 5′ del inserto y el cebador inverso pMAL para secuenciar desde el lado 3′. Cebador directo (24-mer, aguas arriba de MCS) 5′d(GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC)3′ Cebador inverso (24-mer, aguas abajo de MCS) 5′d(TGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC)3′ Las secuencias de los vectores pMAL también están disponibles en www.neb.com. Se puede realizar PCR de insertos clonados en el MCS usando el mismo par de cebadores. P: ¿Cuál es el tamaño mínimo de un fragmento que se puede clonar en pMAL y expresar fusionado a MBP? ¿Se pueden agregar secuencias peptídicas cortas (~ 10 aminoácidos) a MBP? R: El sistema MBP se puede usar para expresar péptidos cortos. Sin embargo, 40 mg de MBP producen ~1 mg de un péptido de 10 aminoácidos (1,1 kDa). P: ¿Cuál es la secuencia de ADN de este producto? R: La secuencia de ADN se puede encontrar en la herramienta Secuencias de ADN y mapas. P: ¿Cuáles son las diferencias entre las generaciones de vectores pMAL (p. ej., pMAL-c2 frente a pMAL-c5 frente a pMAL-c6 o pMAL-p2 frente a pMAL-p5)? R: En todos los vectores, la designación “-c” se refiere a la expresión citoplasmática, es decir, se ha eliminado la secuencia señal que dirige la MBP al espacio periplásmico. Los vectores designados “-p” se refieren a la expresión periplásmica y contienen la secuencia señal malE de tipo salvaje. Vectores pMAL de 1.ª generación: pMAL-c, -cRI y -p son las primeras versiones de los vectores pMAL. pMAL-c y pMAL-p tienen un sitio StuI en el polienlazador para clonar fragmentos de extremos romos. Debido a que la segunda mitad del sitio StuI codifica prolina, si se clonó un fragmento EcoRI en pMAL-c o pMAL-p, el sitio del factor Xa lee IEGRP, y RP no cortará con el factor Xa. pMAL-cRI fue diseñado como una solución a corto plazo para corregir este problema, cambiando el polienlazador para codificar IEGRI aguas arriba del sitio EcoR I. Vectores pMAL-2 de segunda generación: Los vectores pMAL-c2 y pMAL-p2 son la siguiente generación de vectores pMAL. Estos vectores evitan el problema con la escisión del factor Xa al usar un sitio XmnI en lugar de StuI. También tienen un espaciador entre malE y el sitio del factor Xa que permite que algunas fusiones se unan más fuertemente a la resina de amilosa, y un origen M13 para hacer ADN monocatenario. Vectores pMAL de tercera generación: La tercera generación de vectores pMAL se distingue por la adición de vectores que sustituyen un sitio Enteroquinasa o Genenasa I por el sitio del factor Xa. Estos vectores se denominan pMAL-c2E y pMAL-p2E (Enteroquinasa), y pMAL-c2G y pMAL-p2G (Genenase). Las versiones del Factor Xa ahora se denominan pMAL-c2X y pMAL-p2X para mantener la coherencia. Esta tercera generación de vectores también presenta algunas modificaciones menores fuera del polienlazador. El sitio NdeI en el origen pBR322 se destruyó mediante relleno, y se añadió un sitio NdeI en el ATG de malE mediante mutagénesis dirigida. Esto permite cortar una fusión de malE para subclonarla, por ejemplo, en un vector eucariota. El sitio NcoI en malE se destruyó, al igual que el sitio AvaI en el origen M13, lo que hace que el sitio AvaI aguas arriba del sitio del Factor Xa sea único. Vector pMAL-III: Este es un derivado de propósito especial de pMAL-p2, diseñado para facilitar la transferencia directa de secuencias seleccionadas de cualquiera de las bibliotecas de péptidos de visualización en fagos de Ph.D. a un vector de expresión. A diferencia de los otros vectores pMAL, que colocan la secuencia de interés aguas abajo de malE, en este vector la secuencia que codifica el péptido se fusiona al extremo N de malE. Vectores pMAL-4 de 4.ª generación: Los vectores pMAL-4 son similares a los vectores pMAL-2, excepto que la MBP se ha diseñado para una unión más estrecha a la amilosa. La estructura principal del vector y el sitio de clonación múltiple son idénticos a los vectores pMAL-2. Vectores pMAL-5 de 5.ª generación: Los vectores pMAL-5 comparten el gen malE diseñado con los vectores pMAL-4, pero tienen un sitio de clonación múltiple diferente y algunas diferencias en la estructura principal del vector. El sitio de clonación múltiple es idéntico al de pKLAC2 y pTYB21, lo que facilita la subclonación del mismo inserto en múltiples vectores: pKLAC2 para la expresión en K. lactis utilizando el kit de expresión de K. lactis (n.º E1000) o pTYB21 para la expresión en E. coli utilizando el kit IMPACT (n.º E6901). El sitio de clonación múltiple es seguido por codones de parada en los tres marcos, y la estructura del vector no lleva el gen lacZα o el origen M13. Vector pMAL-6 de 6.ª generación: El vector pMAL-c6T comparte el gen malE diseñado con los vectores de la serie pMAL-4 y 5, pero contiene una etiqueta de hexahistidina N-terminal. El vector pMAL-c6T tiene un sitio de clonación múltiple diferente, pero todavía contiene codones de parada en los tres marcos y comparte un subconjunto de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción con las que se encuentran en el vector pKLAC2 para la expresión en K. lactis utilizando el kit de expresión de K. lactis (#E1000) o pTYB21 para la expresión en E. coli utilizando el kit IMPACT (#E6901). Un sitio de reconocimiento de la proteasa TEV ha sido sustituido por el sitio de reconocimiento de la proteasa del factor Xa en el polienlazador entre MBP y la proteína diana de interés. La estructura del vector no lleva el gen lacZα o el origen M13. Téngase en cuenta que no existe un vector de sexta generación para la secreción de proteínas de fusión MBP al periplasma.