New England Biolabs, N0557S, Escalera de ADN de bajo peso molecular púrpura Quick-Load®

Categorías relacionadas Escaleras de ADN púrpura de carga rápida, marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Masa del fragmento (ng) pb 1 42 766 2 27 500 3 20 350 4 33 300 5 27 250 6 110 200 7 33 150 8 43 100 9 58 75 10 63 50 11 43 25 Rango de tamaño efectivo 25 pb a 766 pb Tampón de almacenamiento 2,5 % Ficoll®-400 10 mM EDTA 3,3 mM Tris-HCl 0,001 % Tinte 2 0,02 % Tinte 1 pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué hay bandas adicionales visibles en los geles de poliacrilamida? R: Para aumentar la intensidad de las bandas más pequeñas y las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados en muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, de idéntico tamaño, son indistinguibles en geles de agarosa; sin embargo, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden provocar velocidades de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre presentan la misma migración en acrilamida. En la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que presentan un doblete cercano en agarosa, se separan con mucha claridad en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración anómala es una característica inherente a la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En el caso de la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más de las bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a presentar una distribución diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología de gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Maniatis' Cold Springs Harbor Molecular Cloning Manual, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluida la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin observarse interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones estándar de iluminación UV. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos usar nuestra escala de ADN de 1 kb Plus para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escala de ADN fue optimizada específicamente para esta aplicación. Además, evite usar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos usar el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que se incluye con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo. P: ¿Puedo usar GelRed® con las escaleras de ADN de bajo peso molecular y 50 pb de NEB? R: Sí. Se recomienda encarecidamente usar GelRed para la tinción posterior a la electroforesis para obtener un rendimiento óptimo. Una tinción de 30 minutos suele ser suficiente para una correcta visualización de los fragmentos de ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con GelRed, la migración y la resolución de las escaleras de ADN podrían verse afectadas. Según el fabricante, los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden alterar la migración del ADN durante Electroforesis. En el caso específico de las escaleras de ADN de bajo peso molecular y 50 pb, compuestas por fragmentos de ADN con extremos adhesivos, es probable que las bandas de la escalera se difuminen al precolar los geles con GelRed. La tinción posterior con GelRed proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencias del colorante. Sin embargo, estas escaleras funcionarán correctamente con geles precolados si se someten previamente a un tratamiento de despuntado (mediante una reacción de relleno de polimerasa o de despuntado de nucleasa).