New England Biolabs, N3012S, digestión de ADN lambda HindIII

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Masa del fragmento (ng) pb 1 477 23 130 2 194 9416 3 135 6557 4 90 4361 5 48 2322 6 42 2027 7 12 564 8 3 125 Rango de tamaño efectivo 125 pb a 23 130 pb Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de escalera de ADN? ¿Puedo marcarlos en los extremos utilizando la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué pasa con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos de las escaleras de ADN de bajo peso molecular de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb y el marcador de PCR presentan salientes 5' que pueden marcarse en los extremos con el T4 PNK (NEB# M0201) o rellenarse con el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK puede realizarse mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes en los extremos de los fragmentos mediante CIP o la fosfatasa antártica. Sin embargo, también obtuvimos excelentes resultados con la reacción de intercambio, mucho más sencilla, que aprovecha la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que mejor nos funcionó fue el siguiente: -1 μl de T4 PNK -1 μl de 32P ATP (3000 Ci/mmol, 5 mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Añadir agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Analizar las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos proporciona señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de ug de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Cómo uso el digesto lambda DNA-Hind III? R: Recomendamos cargar 1 ug (2 ul) de Lambda DNA-Hind III. Los fragmentos se pueden separar eficazmente en geles de agarosa que van del 0,6 al 1% utilizando tampones TBE o TAE. Para preparar las muestras, coloque 2 ul del marcador en 13 ul de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) y añada 3 ul de tampón de carga 6X para un volumen final de 18 ul. Caliente las muestras a 60 °C durante 3 minutos y retírelas a hielo o cárguelas inmediatamente en el gel. Cargar más de 1 ug hará que las bandas más grandes parezcan muy anchas y, por lo tanto, más difícil usarlas para una medición precisa. Cargar menos de 0,5 µg dificulta la visualización de las bandas más pequeñas. P: ¿Por qué mi marcador de peso molecular de ADN Lambda aparece borroso y no representa el patrón de bandas correcto? R: Estas aberraciones de bandas casi siempre se deben a la preparación del marcador de peso molecular de ADN para la electroforesis. Por ejemplo, los marcadores de ADN Lambda (digestiones de Hind III y BstE II) requieren un breve calentamiento antes de la electroforesis (recomendamos 3 minutos a 60 °C, seguido de la colocación en hielo o la carga directa en un gel) para disociar los extremos cohesivos de 12 bases de los extremos cohesivos. Sin este calentamiento, la banda de 23 kb y la banda de 4,3 kb de Lambda-Hind III se aparean mediante enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias para formar una banda de 27 kb. Visualmente, esto resulta en una disminución de la intensidad de la banda de 4,3 kb. Sin calentar el ADN lambda-BstE II, las bandas de 8,4 kb y 5,6 kb se alinean para formar una banda de 14 kb. Visualmente, esto produce una disminución de la intensidad de las bandas de 8,4 y 5,6 kb, además de la aparición de una banda de 14 kb. Una advertencia al calentar los marcadores de ADN es que el ADN bicatenario requiere una cantidad mínima de fuerza iónica para evitar su desnaturalización. Esta desnaturalización de las hebras puede resultar en patrones de bandas irregulares o difusos. Por lo tanto, no recomendamos diluir los marcadores de ADN en agua, sino en un tampón con una fuerza iónica mínima, como el tampón TE. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin que se observen interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones estándar de iluminación UV. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos usar nuestra escalera de ADN 1 kb Plus para tinciones seguras (NEB n.º N0559) al usar SYBR o GelRed como tintes prefabricados, ya que esta escalera de ADN fue optimizada específicamente para esta aplicación. Además, evite usar tintes de carga que contengan SDS, ya que el SDS podría causar un patrón de banda anormal en los geles prefabricados. Recomendamos usar el tinte de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS (NEB n.º B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no hay bandas visibles en el carril de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el tinte de carga 6X que se suministra con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.