New England Biolabs, N3019S, mezcla de corte mono de ADN λ

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Fragmento Masa (ng) pb 1 100 48502 2 79 38416 3 69 33498 4 62 29946 5 51 24508 6 49 23994 7 35 17053 8 31 15004 9 21 10086 10 3 1503 Rango de tamaño efectivo 1503 pb a 48 502 pb Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión entre el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de µg de marcador de ADN cargado en el gel. P: Información general sobre Lambda DNA Mono Cut Mix: R: La Lambda DNA Mono Cut Mix requiere electroforesis en gel de campo pulsado o, para la electroforesis en gel regular, un gel de agarosa TAE con un porcentaje muy bajo para separar eficazmente los fragmentos. Algunos errores comunes son acelerar el gel, usar un porcentaje incorrecto de agarosa, usar el tampón incorrecto o cargar demasiado marcador. Para la PFGE en un sistema CHEF, recomendamos usar un gel de agarosa al 1% en tampón TBE 0,5x, que debe procesarse con un sistema de refrigeración, con tiempos de pulso incrementados de 0,5 a 1,5 segundos, durante 20 horas, a 15 °C y 6 V/cm (aproximadamente 200 V). Para la electroforesis en gel convencional, utilice las siguientes condiciones: 0,5 µg de ADN Mono Cut, gel de agarosa al 0,4 % en tampón TAE 1x, 10 V, temperatura ambiente durante 24 horas. Básicamente, el gel debe procesarse muy lentamente para lograr la separación de los fragmentos más grandes. La adición de bromuro de etidio al gel y al tampón de procesamiento a una concentración final de 0,5 µg/ml teñirá eficazmente las bandas durante la electroforesis. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin observarse interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que deba cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones de iluminación UV estándar. P: ¿Puedo usar los colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa pueden prefabricarse con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escalera de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escalera de ADN se optimizó específicamente para esta aplicación. Además, evite utilizar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos utilizar tinte de carga de gel, morado (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación”. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que se incluye con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo. P: ¿Por qué obtengo malos resultados al analizar el marcador PFG en mi gel de campo de pulso? R: Hay varios factores que provocan malos resultados con los marcadores PFG. Aquí tiene una lista de recomendaciones para garantizar un patrón de bandas nítido y de alta calidad: Utilice el sistema Chef DR-II con una rejilla hexagonal de 120 grados (no utilice inversión de campo de 180 grados). Utilice TBE 0,5X nuevo para el tampón de análisis y el gel. Utilice agua de alta calidad (Milli Q) para preparar el tampón y el gel. Cargue el... Marcador como tapón sólido (nunca lo derrita). Cargue una fina capa de marcador, de aproximadamente 1 gradación, en la jeringa (un tapón grueso sobrecargará el pocillo con ADN y producirá un patrón borroso y difuso). Ejecute siempre el programa recomendado para cada marcador. Los programas están optimizados para resolver bandas en el rango de tamaño correspondiente a cada marcador. Intercambiar programas con diferentes marcadores suele resultar en una resolución deficiente. Conserve el marcador a -20 °C.