New England Biolabs, N3026S, digestión de ADN-HaeIII ΦX174

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Masa del fragmento (ng) pb 1 251 1353 2 200 1078 3 162 872 4 112 603 5 58 310 6 102 281/271 7 43 234 8 36 194 9 22 118 10 13 72 Rango de tamaño efectivo 72 pb a 1353 pb Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué la separación de las bandas inferiores es incompleta? R: Las escaleras de bajo peso molecular contienen fragmentos pequeños y requieren tiempos de ejecución prolongados para resolver las bandas de manera efectiva. Para visualizar las bandas más pequeñas, es útil un gel con un porcentaje más alto (hasta un 3% de agarosa, que se obtiene con mayor eficacia utilizando una agarosa de bajo punto de fusión especialmente formulada). Las bandas más pequeñas también tienden a difundirse más que las más grandes durante la electroforesis, por lo que un procesamiento más rápido (a mayor voltaje) puede ser útil, siempre que no se genere demasiado calor. En la mayoría de los sistemas, los geles con un porcentaje del 2% o superior pueden procesarse a un voltaje de 200 durante varias horas sin sufrir daños excesivos por calor. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de ug de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin que se observen interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que deba cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones de iluminación UV estándar. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización o dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del tinte, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escala de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al usar SYBR o GelRed como tintes prefabricados, ya que esta escala de ADN fue optimizada específicamente para esta aplicación. Además, evite usar tintes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos utilizar el tinte de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con ella se ha congelado, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.