New England Biolabs, N3031L, pBR322 ADN-BstNI Digest

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Masa del fragmento (ng) pb 1 426 1857 2 243 1058 3 213 929 4 88 383 5 28 121 6 3 13 Rango de tamaño efectivo 13 pb a 1857 pb Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué la separación de las bandas inferiores es incompleta? R: Las escaleras de bajo peso molecular contienen fragmentos pequeños y requieren tiempos de ejecución prolongados para resolver las bandas de manera efectiva. Para visualizar las bandas más pequeñas, es útil un gel de mayor porcentaje (hasta un 3 % de agarosa, que se realiza de manera más efectiva utilizando una agarosa de bajo punto de fusión especialmente formulada). Las bandas más pequeñas también tienden a difundirse más que las bandas más grandes a medida que se lleva a cabo la electroforesis, por lo que puede ser útil ejecutar la electroforesis más rápido (a mayor voltaje), siempre y cuando no se genere demasiado calor. En la mayoría de los sistemas, los geles del 2% o más se pueden ejecutar a un voltaje de 200 durante varias horas sin daño excesivo por calor. P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de la escalera de ADN? ¿Puedo etiquetarlos en los extremos usando la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué pasa con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos en las escaleras de ADN de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb, de bajo peso molecular y el marcador de PCR tienen salientes 5' que se pueden etiquetar en los extremos con la T4 PNK (NEB# M0201) o rellenar usando el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK se puede hacer mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes de los extremos de los fragmentos usando CIP o la fosfatasa antártica, pero también obtuvimos excelentes resultados usando la reacción de "intercambio" mucho más simple, que utiliza la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que funcionó mejor para nosotros es el siguiente: -1 μl T4 PNK -1 μl 32P ATP (3000Ci/mmol, 5mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Agregue agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Analice las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos produce señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de µg de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin observar interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que deba cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones de iluminación UV estándar. P: ¿Puedo usar los colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa pueden prefabricarse con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escalera de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escalera de ADN se optimizó específicamente para esta aplicación. Además, evite utilizar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos usar el colorante de carga de gel, morado (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.