New England Biolabs, N3032S, pBR322 ADN-MspI Digest

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 31/12/2020. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Fragmento Masa (ng) pb 1 143 622 2 121 527 3 93 404 4 70 307 5 55 242 6 55 238 7 50 217 8 46 201 9 44 190 10 41 180 11 74 160/160 12 68 147/147 13 28 123 14 25 110 15 21 90 16 17 76 17 15 67 18 16 34/34 19 12 26/26 20 3 15 21 4 9/9 Rango de tamaño efectivo 9 pb a Tampón de almacenamiento de 622 pb, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8 a 25 °C. Preguntas frecuentes : P: ¿Por qué la separación de las bandas inferiores es incompleta? R: Las escaleras de bajo peso molecular contienen fragmentos pequeños y requieren tiempos de análisis prolongados para resolver las bandas de forma eficaz. Para visualizar las bandas más pequeñas, es útil un gel con un porcentaje más alto (hasta un 3 % de agarosa, que se realiza con mayor eficacia utilizando una agarosa de bajo punto de fusión especialmente formulada). Las bandas más pequeñas también tienden a difundirse más que las bandas más grandes a medida que se lleva a cabo la electroforesis, por lo que puede ser útil un análisis más rápido (a mayor voltaje), siempre que no se genere demasiado calor. En la mayoría de los sistemas, los geles del 2 % o superior se pueden analizar a un voltaje de 200 durante varias horas sin que se produzcan daños excesivos por calor. P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de la escalera de ADN? ¿Puedo marcarlos en los extremos utilizando la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué ocurre con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos de las escaleras de ADN de bajo peso molecular de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb y el marcador de PCR presentan salientes 5' que pueden marcarse en los extremos con el T4 PNK (NEB# M0201) o rellenarse con el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK puede realizarse mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes en los extremos de los fragmentos mediante CIP o la fosfatasa antártica. Sin embargo, también obtuvimos excelentes resultados con la reacción de intercambio, mucho más sencilla, que aprovecha la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que mejor nos funcionó fue el siguiente: -1 μl de T4 PNK -1 μl de 32P ATP (3000 Ci/mmol, 5 mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Añadir agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Analizar las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos proporciona señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de ug de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin observar interferencias. Por favor, siga las recomendaciones del fabricante del colorante exactamente. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 ug de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones estándar de iluminación UV. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® y/o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Debido a que los colorantes de alta afinidad de unión a ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción post-electroforesis ofrece una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o resolución de algunas escalas de ADN puede verse afectada. Por lo tanto, algunas escalas de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escala de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escala de ADN se optimizó específicamente para esta aplicación. Además, evite utilizar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos utilizar el colorante de carga de gel púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con ella se ha congelado, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.