New England Biolabs, N3231L, escalera de ADN de 100 pb

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Masa del fragmento (ng) pb 1 45 1517 2 35 1200 3 95 1000 4 27 900 5 24 800 6 21 700 7 18 600 8 97 500/517 9 38 400 10 29 300 11 25 200 12 48 100 Rango de tamaño efectivo 100 pb a 1517 pb Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué hay bandas adicionales visibles en los geles de poliacrilamida? R: Para aumentar la intensidad de las bandas más pequeñas y las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados en muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, de idéntico tamaño, son indistinguibles en geles de agarosa; sin embargo, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden provocar velocidades de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre presentan la misma migración en acrilamida. En la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que presentan un doblete cercano en agarosa, se separan con mucha claridad en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración anómala es una característica inherente a la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más de las bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a presentar una distribución diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología de gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Manual de Clonación Molecular de Cold Springs Harbor de Maniati, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Por qué es incompleta la separación de las bandas inferiores? R: Las escaleras de bajo peso molecular contienen fragmentos pequeños y requieren tiempos de análisis prolongados para resolver las bandas eficazmente. Para visualizar las bandas más pequeñas, es útil un gel con un porcentaje mayor (hasta un 3 % de agarosa, que se obtiene de forma más eficaz utilizando una agarosa de bajo punto de fusión especialmente formulada). Las bandas más pequeñas también tienden a difundirse más que las bandas más grandes a medida que se lleva a cabo la electroforesis, por lo que puede ser útil ejecutar la electroforesis más rápido (a mayor voltaje), siempre y cuando no se genere demasiado calor. En la mayoría de los sistemas, los geles del 2% o más se pueden ejecutar a un voltaje de 200 durante varias horas sin daño excesivo por calor. P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de la escalera de ADN? ¿Puedo etiquetarlos en los extremos usando la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué pasa con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos en las escaleras de ADN de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb, de bajo peso molecular y el marcador de PCR tienen salientes 5' que se pueden etiquetar en los extremos con la T4 PNK (NEB# M0201) o rellenar usando el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK se puede hacer mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes de los extremos de los fragmentos usando CIP o la fosfatasa antártica, pero también obtuvimos excelentes resultados usando la reacción de "intercambio" mucho más simple, que utiliza la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que funcionó mejor para nosotros es el siguiente: -1 μl T4 PNK -1 μl 32P ATP (3000Ci/mmol, 5mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Agregue agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Analice las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos produce señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Por qué aparecen las bandas de escalera de ADN en mi Southern blot? ¿Cuál es la secuencia o composición de las bandas de la escalera? R: Este fenómeno se ha observado en diversos laboratorios y, aunque no tenemos una explicación definitiva, existen dos posibles causas de la hibridación, aparentemente improbable, de la sonda del usuario con el ADN de la banda de escalera. Una es que, si la sonda se generó a partir de un plásmido basado en pUC o pBR, podría haber un bajo nivel de contaminación plasmídica en la sonda que hibrida con las bandas de la banda de escalera, la mayoría de las cuales contienen secuencias similares a pUC. Alternativamente, podría existir una homología aleatoria de baja especificidad entre la sonda y algún segmento de los fragmentos de la banda de escalera. Las bandas están compuestas íntegramente de ADN derivado de pUC o ADN de adenovirus 2, que se utiliza como ADN de relleno para generar plásmidos del tamaño adecuado para los marcadores. Dado que la cantidad molar de ADN en las bandas de la escalera suele ser muy superior a la del ADN que se está sondeando, incluso una homología relativamente baja puede resultar en una incorporación suficiente de la sonda para obtener una señal fácilmente detectable. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de µg de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin observar interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones estándar de iluminación UV. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos usar nuestra escala de ADN de 1 kb Plus para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escala de ADN fue optimizada específicamente para esta aplicación. Además, evite usar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos usar el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo. P: ¿Cuáles son las diferencias entre las cuatro versiones de las escaleras de ADN de 1 kb Plus (anteriormente llamada escalera de ADN de 2 logs), de 100 pb y de 1 kb que vende NEB? R: Estas escaleras vienen en cuatro formatos. Elija entre la escalera convencional, la versión Quick-Load® que utiliza colorante púrpura no fluorescente (NEB n.° B7024) o azul de bromofenol como colorante de adhesión, o TriDye™, que contiene tres colorantes que sirven como colorante visual. Ayuda a monitorizar el progreso de la migración durante la electroforesis en gel de agarosa. Las versiones de carga rápida también incluyen un vial de colorante de carga gratuito.