New England Biolabs, N3232S, escalera de ADN de 1 kb

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Fragmento Masa (ng) pb 1 42 10.002 2 42 8.001 3 50 6.001 4 42 5.001 5 33 4.001 6 125 3.001 7 48 2.000 8 36 1.500 9 42 1.000 10a 21 517 10b 21 500 Rango de tamaño efectivo 500 pb a 10.002 pb Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué hay bandas adicionales visibles en los geles de poliacrilamida? R: Para aumentar la intensidad de las bandas más pequeñas y las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados en muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, de idéntico tamaño, son indistinguibles en geles de agarosa; sin embargo, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden provocar velocidades de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre presentan la misma migración en acrilamida. En la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que presentan un doblete cercano en agarosa, se separan con mucha claridad en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración anómala es una característica inherente a la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En el caso de la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más de las bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a presentar una distribución diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología de gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Maniatis' Cold Springs Harbor Molecular Cloning Manual, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de la escalera de ADN? ¿Puedo etiquetarlos en los extremos con la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué ocurre con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos de las escaleras de ADN de bajo peso molecular de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb y el marcador de PCR presentan salientes 5' que pueden marcarse en los extremos con el T4 PNK (NEB# M0201) o rellenarse con el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK puede realizarse mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes en los extremos de los fragmentos mediante CIP o la fosfatasa antártica. Sin embargo, también obtuvimos excelentes resultados con la reacción de intercambio, mucho más sencilla, que aprovecha la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que mejor nos funcionó es el siguiente: -1 μl de T4 PNK -1 μl de 32P ATP (3000Ci/mmol, 5 mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Añadir agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Procese las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos proporciona señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble de la señal cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Por qué aparecen las escaleras de ADN en mi Southern blot? ¿Cuál es la secuencia o composición de las bandas de la escalera? R: Este fenómeno se ha observado en diversos laboratorios y, aunque no tenemos una explicación definitiva, existen dos posibles causas de la aparentemente improbable hibridación de la sonda del usuario con el ADN de la escalera. Una es que, si la sonda se generó a partir de un plásmido basado en pUC o pBR, podría haber un bajo nivel de contaminación plasmídica en la sonda que hibrida con las bandas de la escalera, la mayoría de las cuales contienen secuencias similares a pUC. Alternativamente, podría existir una homología aleatoria de baja especificidad entre la sonda y algún segmento de los fragmentos de la escalera. Las bandas están compuestas íntegramente de ADN derivado de pUC o ADN del adenovirus 2, que se utiliza como ADN de relleno para generar plásmidos del tamaño adecuado para los marcadores. Dado que la cantidad molar de ADN en las bandas de la escalera suele ser muy superior a la del ADN que se está sondeando, incluso una homología relativamente baja puede resultar en una incorporación suficiente de la sonda para producir una señal fácilmente detectable. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión entre el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de µg de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin ninguna interferencia. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones de iluminación UV estándar. P: ¿Puedo usar los colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa pueden prefabricarse con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escalera de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escalera de ADN se optimizó específicamente para esta aplicación. Además, evite utilizar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos usar el colorante de carga de gel, morado (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.