New England Biolabs, N3233S, escalera de ADN de bajo peso molecular

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Fragmento Masa (ng) pb 1 42 766 2 27 500 3 20 350 4 33 300 5 27 250 6 110 200 7 33 150 8 43 100 9 58 75 10 63 50 11 43 25 Rango de tamaño efectivo 25 pb a 766 pb Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué hay bandas adicionales visibles en los geles de poliacrilamida? R: Para proporcionar una mayor intensidad para las bandas más pequeñas y las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados para muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, de tamaño idéntico, son indistinguibles en geles de agarosa, pero, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden dar lugar a tasas de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre se comportan igual en acrilamida. En el caso de la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que se comportan como un doblete cercano en agarosa, se separan muy claramente en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración "anómala" es una característica inherente de la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En el caso de la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más de las bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a comportarse de forma diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología de gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Manual de Clonación Molecular de Cold Springs Harbor de Maniatis, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Por qué es incompleta la separación de las bandas inferiores? R: Las escaleras de bajo peso molecular contienen fragmentos pequeños y requieren tiempos de análisis prolongados para resolver las bandas eficazmente. Para visualizar las bandas más pequeñas, resulta útil un gel con un porcentaje más alto (hasta un 3 % de agarosa, que se obtiene con mayor eficacia utilizando una agarosa de bajo punto de fusión especialmente formulada). Las bandas más pequeñas también tienden a difundirse más que las más grandes durante la electroforesis, por lo que un análisis más rápido (a mayor voltaje) puede ser útil, siempre que no se genere demasiado calor. En la mayoría de los sistemas, los geles con un 2% o más de densidad pueden procesarse a un voltaje de 200 V durante varias horas sin sufrir daños por calor excesivo. P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de la escalera de ADN? ¿Puedo etiquetarlos con la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué ocurre con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos de las escaleras de ADN de bajo peso molecular de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb y el marcador de PCR tienen salientes 5' que pueden etiquetarse con la polinucleótido quinasa T4 (NEB# M0201) o rellenarse con el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK se puede hacer mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes de los extremos de los fragmentos usando CIP o la fosfatasa antártica, pero también obtuvimos excelentes resultados usando la reacción de "intercambio" mucho más simple, que utiliza la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que funcionó mejor para nosotros es el siguiente: -1 μl T4 PNK -1 μl 32P ATP (3000Ci/mmol, 5mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Agregue agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Analice las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos produce señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Por qué aparecen las bandas de escalera de ADN en mi Southern blot? ¿Cuál es la secuencia o composición de las bandas de la escalera? R: Este fenómeno se ha observado en diversos laboratorios y, aunque no tenemos una explicación definitiva, existen dos posibles causas de la hibridación, aparentemente improbable, de la sonda del usuario con el ADN de la banda de escalera. Una es que, si la sonda se generó a partir de un plásmido basado en pUC o pBR, podría haber un bajo nivel de contaminación plasmídica en la sonda que hibrida con las bandas de la banda de escalera, la mayoría de las cuales contienen secuencias similares a pUC. Alternativamente, podría existir una homología aleatoria de baja especificidad entre la sonda y algún segmento de los fragmentos de la banda de escalera. Las bandas están compuestas íntegramente de ADN derivado de pUC o ADN de adenovirus 2, que se utiliza como ADN de relleno para generar plásmidos del tamaño adecuado para los marcadores. Dado que la cantidad molar de ADN en las bandas de la escalera suele ser muy superior a la del ADN que se está sondeando, incluso una homología relativamente baja puede resultar en una incorporación suficiente de la sonda para obtener una señal fácilmente detectable. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de µg de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin observar interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones estándar de iluminación UV. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos usar nuestra escala de ADN de 1 kb Plus para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escala de ADN fue optimizada específicamente para esta aplicación. Además, evite usar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos usar el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que se incluye con la escalera se ha congelado en algún momento, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo. P: ¿Puedo usar GelRed® con las escaleras de ADN de bajo peso molecular y 50 pb de NEB? R: Sí. Se recomienda encarecidamente usar GelRed para la tinción posterior a la electroforesis para obtener un rendimiento óptimo. Una tinción de 30 minutos suele ser suficiente para una correcta visualización de los fragmentos de ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con GelRed, la migración y la resolución de las escaleras de ADN podrían verse afectadas. Según el fabricante, los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden alterar la migración del ADN durante Electroforesis. En el caso específico de las escaleras de ADN de bajo peso molecular y 50 pb, compuestas por fragmentos de ADN con extremos adhesivos, es probable que las bandas de la escalera se difuminen al precolar los geles con GelRed. La tinción posterior con GelRed proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencias del colorante. Sin embargo, estas escaleras funcionarán correctamente con geles precolados si se someten previamente a un tratamiento de despuntado (mediante una reacción de relleno de polimerasa o de despuntado de nucleasa).