New England Biolabs, N3234S, marcador de PCR

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Fragmento Masa (ng) pb 1 62 766 2 40 500 3 48 300 4 61 150 5 89 50 Rango de tamaño efectivo 50 pb a 766 pb Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Qué son los salientes en los fragmentos de escalera de ADN? ¿Puedo marcarlos en los extremos utilizando la polinucleótido quinasa T4 (PNK)? ¿Qué pasa con el fragmento Klenow? R: Todos los fragmentos de las escaleras de ADN de bajo peso molecular de 1 kb, 100 pb, 1 kb Plus, 50 pb y el marcador de PCR presentan salientes 5' que pueden marcarse en los extremos con el T4 PNK (NEB# M0201) o rellenarse con el fragmento Klenow (NEB# M0212). El marcaje con PNK puede realizarse mediante el protocolo estándar de eliminación de los grupos fosfato existentes en los extremos de los fragmentos mediante CIP o la fosfatasa antártica. Sin embargo, también obtuvimos excelentes resultados con la reacción de intercambio, mucho más sencilla, que aprovecha la capacidad de la quinasa para eliminar los fosfatos existentes del ADN y reemplazarlos con fosfatos marcados. El procedimiento que mejor nos funcionó fue el siguiente: -1 μl de T4 PNK -1 μl de 32P ATP (3000 Ci/mmol, 5 mCi/ml) -2 μl de tampón 10x T4 PNK -1 o 2 μl de escalera de ADN (1 μg) Añadir agua destilada a 20 μl. La reacción se lleva a cabo a 37 °C durante 30 minutos. Analizar las muestras durante 50 a 60 minutos a 100 V en tampón TBE en un gel de acrilamida al 4-20 % (10 cm x 10 cm). Una exposición de 20 minutos proporciona señales muy legibles. La intensidad de la señal es aproximadamente el doble cuando se añade ADP a 100 μM. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de ug de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN de NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB #N0550), son compatibles con el tinte Midori Green sin observar interferencias. Por favor, siga las recomendaciones del fabricante del tinte exactamente. Debido a la baja intensidad del tinte, es posible que necesite cargar entre 1 y 2 ug de la escalera de ADN para lograr una buena visualización bajo condiciones estándar de iluminación UV. P: ¿Por qué hay bandas adicionales visibles en los geles de poliacrilamida? R: Para proporcionar mayor intensidad para las bandas más pequeñas y las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados para muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, de tamaño idéntico, son indistinguibles en geles de agarosa, pero, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden dar lugar a tasas de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre se comportan igual en acrilamida. En el caso de la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que se comportan como un doblete cercano en agarosa, se separan muy claramente en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración "anómala" es una característica inherente de la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En el caso de la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más de las bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a comportarse de forma diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología de gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Manual de Clonación Molecular de Cold Springs Harbor de Maniatis, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Puedo usar los colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escalas de ADN pueden requerir optimización/dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escala de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escala de ADN se optimizó específicamente para esta aplicación. Además, evite utilizar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos utilizar el colorante de carga de gel púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con ella se ha congelado, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.