New England Biolabs, N3238S, Escalera de ADN rápida

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Masa del fragmento (ng) pb 1 36 10 002 2 36 5001 3 36 3001 4 38 2000 5 28 1500 6 108 1000 7 43 766 8 40 500 9 33 300 10 41 150 11 61 50 Rango de tamaño efectivo 50 pb a 10 002 pb Tampón de almacenamiento 0,002 % Xileno cianol 5 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 5 % Glicerol pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Cuánta escalera de ADN rápida debo cargar en un gel? R: Para un sistema de electroforesis estándar, recomendamos cargar 0,5 µg (20 µl) de Fast DNA Ladder en el gel de agarosa. Para un sistema de electroforesis rápido (separación de 5 a 30 minutos), siga las recomendaciones del fabricante del sistema: una carga de 5 a 20 µl. Podría ser necesaria una dilución de la escalera. P: ¿Qué porcentaje de gel de agarosa debo usar? R: La mejor separación se produce en un gel de agarosa TAE al 1,2 %, pero también puede usar un gel TBE. Por debajo del 1 %, es posible que el fragmento de 50 pb no se separe del de 150 pb. P: ¿Puedo almacenarlo a -20 °C? R: Para un almacenamiento prolongado, puede almacenarlo a 4 °C o -20 °C. Si se almacena a -20 °C, mezcle bien después de descongelar, ya que el colorante y el Ficoll-400 pueden formar un gradiente en el vial. P: ¿Por qué se observan bandas adicionales en los geles de poliacrilamida? R: Para aumentar la intensidad de las bandas más pequeñas y las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados en muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, de tamaño idéntico, son indistinguibles en geles de agarosa; sin embargo, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden provocar velocidades de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre presentan la misma migración en acrilamida. En la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que presentan un doblete cercano en agarosa, se separan con mucha claridad en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración anómala es una característica inherente a la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a presentar una distribución diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología de gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Maniatis' Cold Springs Harbor Molecular Cloning Manual, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Funciona la escalera de ADN rápida con el sistema de ADN FlashGel® o el sistema de electroforesis de agarosa prefabricada E-Gel®? R: La escalera de ADN rápida ha sido probada y es compatible con geles FlashGel® al 1,2%, geles E-Gel® al 0,8%, 1,2% y 2% con bromuro de etidio o colorante SYBR. Esta escalera de ADN también es compatible con los geles E-Gel® EX al 1% y 2%, E-Gel® NGS, E-Gel® SizeSelect y E-Gel® CloneWell, pero puede requerir una dilución de ½ a ¼ en agua para obtener resultados óptimos. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o resolución de algunas escaleras de ADN puede verse afectada. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización o dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del colorante, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escalera de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al utilizar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados, ya que esta escalera de ADN se optimizó específicamente para esta aplicación. Además, evite utilizar colorantes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos utilizar el colorante de carga de gel púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con ella se ha congelado, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.