New England Biolabs, N3271S, escalera de ADN TriDye™ de 100 pb

Categorías relacionadas Marcadores y escaleras de ADN Aplicaciones Análisis de ADN Especificación Bases Fragmento Masa (ng) pb 1 45 1517 2 35 1200 3 95 1000 4 27 900 5 24 800 6 21 700 7 18 600 8 97 500/517 9 38 400 10 29 300 11 25 200 12 48 100 Rango de tamaño efectivo 100 pb a 1517 pb Tampón de almacenamiento 0,006 % Xileno cianol 10 mM Tris-HCl 10 mM EDTA 10 % Glicerol 0,006 % Azul de bromofenol 0,06 % Naranja G pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Por qué las escaleras de ADN son ¿Aparece en mi Southern blot? ¿Cuál es la secuencia o composición de las bandas de la escalera? R: Este fenómeno se ha observado en diversos laboratorios y, aunque no tenemos una explicación definitiva, existen dos posibles causas de la aparentemente improbable hibridación de la sonda del usuario con el ADN de la escalera. Una es que, si la sonda se generó a partir de un plásmido basado en pUC o pBR, podría haber un bajo nivel de contaminación plasmídica en la sonda que hibrida con las bandas de la escalera, la mayoría de las cuales contienen secuencias similares a pUC. Alternativamente, podría haber simplemente una homología aleatoria de baja especificidad entre la sonda y algún segmento de los fragmentos de la escalera. Las bandas consisten completamente en ADN derivado de pUC o ADN del adenovirus 2, que se utiliza como ADN de relleno para generar plásmidos del tamaño adecuado para los marcadores. Debido a que la cantidad molar de ADN en las bandas de la escalera suele ser muy superior a la del ADN que se está sondeando, incluso una homología relativamente baja puede resultar en una incorporación suficiente de la sonda para obtener una señal fácilmente detectable. P: ¿Cómo puedo cuantificar la cantidad de ADN en cada banda de un marcador? R: La cantidad de ADN en cada banda se puede determinar dividiendo el tamaño (pb) de la banda en cuestión por el tamaño (pb) de la molécula de ADN sin cortar y multiplicando este número por el total de ug de marcador de ADN cargado en el gel. P: ¿Por qué hay bandas adicionales visibles en los geles de poliacrilamida? R: Para proporcionar una mayor intensidad a las bandas más pequeñas y a las bandas de referencia, se han clonado múltiples fragmentos del mismo tamaño en los plásmidos utilizados para muchas de las escaleras de ADN. Estos fragmentos, idénticos en tamaño, son indistinguibles en geles de agarosa, pero, en geles de acrilamida, incluso pequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden provocar tasas de migración notablemente diferentes. Los fragmentos del mismo tamaño no siempre se comportan igual en acrilamida. En la escalera de ADN de 100 pb, los fragmentos de 500 y 517 pb, que se comportan como un doblete cercano en agarosa, se separan con mucha claridad en acrilamida, con la banda de 517 pb aproximadamente a medio camino entre los fragmentos de 500 y 600 pb. Esta migración "anómala" es una característica inherente a la electroforesis en gel de acrilamida y no indica ningún error en el tamaño indicado de los fragmentos de ADN en nuestra escalera. En la escalera de ADN de 50 pb y la escalera de bajo peso molecular, dos o más de las bandas que componen la banda de referencia de 200 pb tienden a comportarse de forma diferente, lo que resulta en una o más bandas adicionales detectables alrededor del rango de 200 pb. Al igual que con la escalera de ADN de 100 pb, esto se atribuye más a las limitaciones de la tecnología del gel de acrilamida que a un problema con la composición de la escalera. Como se define en la mayoría de los manuales de laboratorio de biología molecular (Manual de Clonación Molecular de Cold Springs Harbor de Maniatis, 2.ª edición) y como reconocen los fabricantes de geles de acrilamida, las aplicaciones que requieren una medición precisa del tamaño de los fragmentos de ADN deben realizarse con geles de agarosa siempre que sea posible. P: ¿Cuáles son las diferencias entre las cuatro versiones de las escaleras de ADN de 1 kb Plus (anteriormente denominadas 2-Log DNA Ladder), de 100 pb y de 1 kb que vende NEB? R: Estas escaleras vienen en cuatro formatos. Puede elegir entre la escalera convencional, la versión Quick-Load®, que utiliza colorante púrpura no fluorescente (NEB n.° B7024) o azul de bromofenol como colorante de adhesión, o TriDye™, que contiene tres colorantes que sirven como ayuda visual para monitorizar el progreso de la migración durante la electroforesis en gel de agarosa. Las versiones de carga rápida también incluyen un vial de colorante de carga gratuito. P: ¿Puedo usar Midori Green con las escaleras de ADN de NEB? R: Las escaleras de ADN NEB, incluyendo la escalera de ADN Quick-Load Purple 1 kb Plus (NEB n.° N0550), son compatibles con el colorante Midori Green sin que se observen interferencias. Siga estrictamente las recomendaciones del fabricante del colorante. Debido a la baja intensidad del colorante, es posible que deba cargar entre 1 y 2 µg de la escalera de ADN para lograr una buena visualización en condiciones de iluminación UV estándar. P: ¿Puedo usar colorantes SYBR® o GelRed® con las escaleras de ADN de NEB? R: Dado que los colorantes de alta afinidad para la unión de ácidos nucleicos pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con los colorantes SYBR y GelRed. La tinción posterior a la electroforesis proporciona una sensibilidad superior y elimina la posibilidad de interferencia del colorante con la migración del ADN. Si bien los geles de agarosa se pueden prefabricar con estos colorantes, la migración o la resolución de algunas escaleras de ADN pueden verse afectadas. Por lo tanto, algunas escaleras de ADN pueden requerir optimización o dilución al procesarse en geles prefabricados con estos colorantes. Para obtener resultados óptimos, siga atentamente las recomendaciones y protocolos del fabricante del tinte, especialmente en lo que respecta a las cantidades de carga. Recomendamos utilizar nuestra escala de ADN Plus de 1 kb para tinciones seguras (NEB n.° N0559) al usar SYBR o GelRed como tintes prefabricados, ya que esta escala de ADN fue optimizada específicamente para esta aplicación. Además, evite usar tintes de carga que contengan SDS, ya que este podría causar un patrón de bandas anormal en los geles prefabricados. Recomendamos utilizar el tinte de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS (NEB n.° B7025) para esta aplicación. P: ¿Por qué mi escalera de ADN flota fuera de los pocillos? ¿Por qué no se ven bandas en la línea de gel de mi escalera de ADN? R: Si la escalera de ADN lista para cargar o el colorante de carga 6X que viene con ella se ha congelado, el Ficoll formará un gradiente de densidad en el vial al descongelarse. Cualquier volumen pipeteado desde la parte superior del vial contendrá solo una pequeña cantidad de agente densificador y flotará fuera de los pocillos. Para evitar esto, mezcle bien al recibirlo y antes de usarlo.