New England Biolabs, N6707S, vector pTXB1

pTXB1 es un sistema IMPACT de categorías relacionadas , expresión de proteínas en bacterias de E. coli, plásmidos y sustratos de ADN, aplicaciones de expresión de proteínas en E. coli, especificación de expresión de proteínas , etiqueta de afinidad, dominio de unión a quitina (CBD). Preguntas frecuentes : P: ¿Qué vectores incluye el kit IMPACT? R: El kit IMPACT incluye tres vectores de expresión de E. coli, lo que permite la fusión de la etiqueta de inteína escindible al extremo C-terminal (pTXB1) o al extremo N-terminal (pTYB11) de la proteína diana. El vector pMXB10 sirve como control positivo para la expresión y purificación, y también puede utilizarse como vector de clonación. pTXB1 (#N6707S) contiene una miniinteína del gen gyrA de Mycobacterium xenopi (inteína GyrA Mxe; 198 residuos de aminoácidos) que se ha modificado para experimentar una escisión inducida por tiol en su extremo N-terminal (Evans, TC, et al. (1998) Semisíntesis de proteínas citotóxicas mediante un elemento de empalme de proteínas modificado. Protein Sci. 7, 2256–2264; Southworth, MW, et al.(1999) BioTechniques 27, 110–120). El vector permite la purificación de una proteína diana sin aminoácidos adicionales mediante la clonación en los sitios NdeI y SapI. La proteína objetivo se fusiona en su extremo C a una etiqueta de inteína autoescindible (~28 kD) que contiene el dominio de unión de quitina (CBD, 6 kDa), lo que permite la purificación por afinidad del precursor de fusión en una columna de quitina. El vector pTYB11 (#N6701S) utiliza una inteína del gen VMA1 de Saccharomyces cerevisiae (intemína Sce VMA1; 454 aminoácidos) (Chong, S. et al. (1998) Utilizando la actividad de escisión C-terminal de un elemento de empalme de proteínas para purificar proteínas recombinantes en un solo paso cromatográfico. Nucl. Acids Res. 26, 5109–5115; Chong, S., et al. (1998) Modulación del empalme de proteínas de la inteína ATPasa de membrana vacuolar de Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273, 10567–77). La proteína diana se fusiona en su extremo N a una etiqueta inteína-CBD VMA1 autoescindible (56 kD); La etiqueta permite la purificación por afinidad del precursor de fusión en una columna de quitina. El vector está diseñado para permitir la purificación de una proteína diana sin aminoácidos adicionales, o sin un residuo de metionina N-terminal, mediante la clonación de su extremo 5' en el sitio SapI. El vector de control, pMXB10 (#N6903S), derivado de pTXB1, lleva la proteína diana de control, la proteína de unión a maltosa (MBP), ya insertada aguas arriba de la inteína-CBD de Mxe GyrA. La inducción produce la fusión MBP-GyrA inteína-CBD que, cuando se escinde, resulta en la elución de MBP. Las regiones polienlazadoras que flanquean la región codificante para MBP se pueden usar convenientemente para clonar un gen de interés. Sin embargo, después de la escisión de la inteína, la proteína diana contendrá aminoácidos adicionales en su extremo C-terminal, incluyendo (LEY), que ha tenido una alta tasa de escisión exitosa. Los vectores IMPACT utilizan un promotor T7 para proporcionar un control estricto de la expresión del gen de fusión en E. coli (Dubendorff, JW y Studier, FW (1991) Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219, 45–59.). Los vectores IMPACT llevan el marcador del gen Ampr (el gen bla), que transmite resistencia a la ampicilina a la cepa huésped; un vector, pKYB1 (#N6706S), es resistente a la kanamicina (disponible por separado). P: ¿Cuál es la secuencia de ADN de este producto? R: La secuencia de ADN se puede encontrar en la herramienta de secuencias y mapas de ADN.