New England Biolabs, N6845S, ARNt de E. coli

Categorías relacionadas PURExpress® Síntesis de proteínas in vitro, Expresión de proteínas acelulares, Purificación de proteínas, Aplicaciones PURExpress, Expresión de proteínas en, Preguntas frecuentes sobre E. coli P: ¿Puedo usar ARNt de E. coli (NEB n.º N6845) con sistemas de traducción de levaduras, insectos, mamíferos u otros eucariotas? R: Aunque los mecanismos de traducción son muy similares en sistemas procariotas y eucariotas, los pasos de iniciación muestran diferencias importantes: por ejemplo, en sistemas eucariotas, el metionil-ARNt (Met-ARNit) no está formilado e interactúa (inicia) con el ribosoma como un complejo con eIF2 y GTP. Por lo tanto, una mezcla de ARNt procariotas carecerá de todos los atributos necesarios para mantener una síntesis de proteínas eficaz en presencia de ribosomas eucariotas. P: ¿Cómo se purifica el ARNt de E. coli (NEB n.º N6845)? R: El ARNt N6845 de E. coli se extrae de células de E. coli. El ARN de transferencia se purifica mediante una serie de separaciones cromatográficas, directamente de un lisado celular y evitando cualquier paso de precipitación que involucre solventes orgánicos. La solución final se proporciona en un tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y está libre de contaminantes orgánicos. P: Quiero suplementar con un aminoácido no natural y me gustaría saber la composición individual del ARNt. R: La concentración final de todos los ARNt en este producto es de 35 mg/mL. Dicho esto, los ARNt se purifican como un pool total de E. coli y asumimos que están presentes en la proporción en la que existen in vivo. P: Si mi plantilla no está optimizada para E. coli, ¿tengo que suplementar el ARNt de E. coli (NEB #N6845) con ARNt de codones raros? R: Los truncamientos frecuentes son una señal de que la traducción puede estancarse en posiciones de codones raros. En lugar de complementar los ARNt raros (cuya purificación es difícil), una mejor estrategia consiste en optimizar los codones de la plantilla. Si bien la mera presencia de un codón raro podría afectar la eficiencia de la traducción, esta no es la única causa de una traducción deficiente o de truncamientos. Otros factores pueden tener un efecto mucho mayor: la cantidad de codones raros consecutivos presentes, la secuencia diana (regiones UTR 5' y 3', etiquetas N- o C-terminales), la concentración de la plantilla y las condiciones de incubación. P: ¿Qué aplicaciones son compatibles con el ARNt de E. coli (NEB n.° N6845)? R: Este ARNt está listo para su uso en la traducción de proteínas in vitro en sistemas de E. coli, la visualización de ribosomas, la visualización de ARNm y otras aplicaciones de biología molecular.