New England Biolabs, N6951S, vector pTWIN1

pTWIN1 es un sistema IMPACT de categorías relacionadas , expresión de proteínas en bacterias E. coli, plásmidos y sustratos de ADN, especificación de dominio de unión a quitina con etiqueta de afinidad (CBD) Preguntas frecuentes P: ¿Qué es IMPACT? R: IMPACT, purificación mediada por inteína con una etiqueta de unión a quitina de afinidad, es un novedoso sistema de purificación de proteínas que permite purificar proteínas recombinantes sin una etiqueta de afinidad en un solo paso cromatográfico. Este método se desarrolló en New England Biolabs (NEB) a partir de estudios del mecanismo de empalme de proteínas (véanse las referencias en 1.10 y 1.11). Se distingue de todos los demás sistemas de purificación por su capacidad de purificar una proteína recombinante con su secuencia nativa mediante una sola columna de afinidad, sin el uso de una proteasa. El sistema IMPACT utiliza la actividad de autoescisión inducible de un elemento de empalme de proteínas diseñado (inteína) para separar la proteína diana de la etiqueta de afinidad. La proteína diana se fusiona a una etiqueta compuesta por la inteína y el dominio de unión a quitina (CBD), lo que permite la purificación por afinidad del precursor de fusión en la columna de quitina. La inteína sufre una escisión específica mediante un reactivo tiol o un cambio de pH y temperatura que libera la proteína diana de la etiqueta unida a quitina, lo que resulta en una purificación en una sola columna de la proteína diana. El sistema IMPACT incluye una serie de vectores de expresión de E. coli que utilizan inteínas modificadas genéticamente de 134 a 454 residuos de aminoácidos. Estos vectores están diseñados para la expresión y purificación de proteínas en E. coli, así como para la manipulación de proteínas como el marcaje, la ligación y la ciclización de proteínas. El kit IMPACT, así como los vectores que se venden por separado, están disponibles para satisfacer sus necesidades de investigación. La compatibilidad de los múltiples sitios de clonación de los vectores permite la inserción del mismo fragmento del gen diana en diferentes vectores para una expresión y purificación óptimas. El gen que codifica la proteína diana se inserta en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión IMPACT para crear una fusión en marco entre el gen diana y la etiqueta de afinidad que consiste en el dominio de unión a la inteína y la quitina (CBD, 52 residuos de aminoácidos). Cuando los extractos crudos de células de E. coli inducidas se pasan por una columna de quitina, la proteína de fusión de la proteína diana inteína-CBD se une a las perlas de quitina mientras que todos los demás contaminantes se eliminan de la columna. La escisión en columna se induce a 4 °C mediante la adición de un agente reductor (como DTT) o el cambio de temperatura y pH (vectores pTWIN). La proteína diana se libera mientras la etiqueta inteína-CBD permanece unida a la columna, lo que resulta en una purificación de la proteína diana en una sola columna. El kit IMPACT contiene vectores de expresión que permiten la fusión de la etiqueta inteína escindible al extremo C-terminal (pTXB1) o al extremo N-terminal (pTYB11) de la proteína diana. Esta flexibilidad en la construcción de proteínas de fusión maximiza la probabilidad de expresión y purificación exitosas de una proteína diana. Los vectores pTWIN (#N6951S y #N6952S) ofrecen muchas ventajas: (1) el aislamiento fácil de proteínas nativas sin el uso de un reactivo de tiol, utilizando el cambio de pH y temperatura (Inteína 1) (2) el aislamiento de proteínas con una cisteína N-terminal [para la ligadura mediada por inteína (IPL)] o un residuo distinto de la metionina sin el uso de proteasas exógenas que pueden ser costosas e inespecíficas (3) la purificación de proteínas con un tioéster C-terminal para su uso en reacciones de IPL que pueden insertar aminoácidos no codificados en una proteína o marcar una proteína expresada en bacterias (4) la generación de especies de proteínas circulares. Todos los vectores utilizan un promotor T7 y el gen lacI para proporcionar un control riguroso de la expresión del gen de fusión. La unión del represor lac a la secuencia del operador lac inmediatamente aguas abajo del promotor T7 suprime la expresión basal del gen de fusión en ausencia de inducción de IPTG. Todos los vectores contienen el marcador del gen Ampr (el gen bla), que confiere resistencia a la ampicilina a la cepa huésped, excepto pKYB1 (#N6706S), que contiene el gen de resistencia a la kanamicina. P: ¿Cuál es la secuencia de ADN de este producto? R: La secuencia de ADN se puede encontrar en la herramienta de secuencias y mapas de ADN.