Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, P0702S, Endo H

La endoglicosidasa H es una glicosidasa recombinante que escinde dentro del núcleo de quitobiosa de la alta manosa y algunos oligosacáridos híbridos de las glicoproteínas ligadas a N. También está disponible una versión etiquetada, que es una fusión de proteína recombinante de la endoglicosidasa H y la proteína de unión a maltosa, Endo H Categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Proteómica, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para eliminar > 95% del carbohidrato de 10 µg de RNasa B desnaturalizada en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl (10 unidades NEB = 1 miliunidad IUB). Ensayo de definición de unidad: se desnaturalizan 10 µg de RNasa B con tampón desnaturalizante de glicoproteínas 1X a 100 °C durante 10 minutos. Después de la adición de 1X GlycoBuffer 3, se añaden diluciones dobles de Endo H y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza por SDS-PAGE. 1X Glycoprotein Denaturing Buffer 0.5% SDS 40 mM DTT Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 3 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 3 50 mM acetato de sodio (pH 6 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7.5 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Peso molecular Aparente: 29 kDa Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGase F, Endo H y O-Glycosidase? A: PNGase F elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn); alta manosa, híbrida, bi, tri y tetraantenaria. Elegirá esta enzima si su objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. Endo H elimina solo alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Elegiría esta enzima para determinar con mayor precisión el tipo de glicosilación ligada a N, o si sabe que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. La O-glicosidasa de NEB eliminará los disacáridos desialiados del núcleo 1 y del núcleo 3 ligados a O unidos a residuos Ser/Thr. P: ¿Cuál es la diferencia entre Endo H y Endo Hf? R: Endo H y Endo Hf son la misma enzima, pero Endo Hf es la proteína de fusión de Endo H y MBP. El clon fue diseñado con la MBP unida para ayudar en la purificación de la enzima. La proteína de fusión tiene una actividad idéntica al clon sin fusión. No hay diferencia de actividad entre Endo H y Endo Hf en una glicoproteína. P: Probé Endo H/Hf en mi glicoproteína y falló. ¿Cuál podría ser el problema? R: Primero, ¿sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido a N o a O (a un Asp o Ser/Thr)? Segundo, ¿el sustrato del carbohidrato es de tipo alto en manosa? Si no está seguro, una endoglicosidasa más general, la PNGasa F, podría ser la enzima más apropiada. Si está seguro de que hay carbohidratos altos en manosa unidos a N, asegúrese de haber desnaturalizado la proteína antes de la desglicosilación. La estructura secundaria y terciaria de las proteínas a menudo impide que las endoglicosidasas alcancen su sustrato, lo que hace que la desnaturalización sea un paso crucial para una escisión eficiente. Si no desea desnaturalizar, considere agregar más enzima e incubar por más tiempo. Recuerde que Endo H/Hf elimina específicamente solo los carbohidratos con alto contenido de manosa y algunos carbohidratos de tipo híbrido de las glicoproteínas. Si el carbohidrato es más complejo, Endo H no se escindirá. La PNGasa F es útil para eliminar todos los tipos de carbohidratos N-enlazados de las glicoproteínas. P: ¿Cuánta Endo H/Endo Hf debo usar? R: 1-2 ul de Endo H/Hf son suficientes para desglicosilar de 5 a 20 μg de glicoproteína desnaturalizada en una hora. P: ¿El SDS inhibe Endo H/Endo Hf? R: No. P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para Endo H? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: 1. Combine de 1 a 20 µg de glicoproteína, 1 µl de tampón desnaturalizante de glicoproteínas 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 µl. 2. Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. 3. Prepare un volumen de reacción total de 20 µl añadiendo 2 µl de 10X Glyco Buffer 3, H2O y 1-5 µl de Endo H. 4. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Las reacciones se pueden escalar linealmente para acomodar volúmenes de reacción mayores. P: ¿Son aceptables los inhibidores de la proteasa para su uso en una reacción Endo H/Hf? R: Aprotinina (concentración final de 10 μg/ml)Benzamidina (concentración final de 1 mM)Pepstatina (concentración final de 10 μg/ml)Leupeptina (concentración final de 1 μM)EGTA (concentración final de 1 mM)EDTA (concentración final de 1 mM)PMSF (concentración final de 1 mM)Prepare una solución madre concentrada 1000X de cada inhibidor en agua; Excepto la pepstatina, que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteínas. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Por qué las enzimas NEB glicosidasas han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir utilizando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? A: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se proporcionan con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se proporcionan con GlycoBuffer 4. Además, el panel de tampones para endoglicosidasas se ha simplificado. La actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa se evaluó tanto en su sistema de tampón antiguo como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o se encontró que tenían una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas todavía se proporcionan con un vial adicional de rHSA (rHSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas todavía se proporcionan con un vial adicional de BSA (BSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (es decir, tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) todavía se proporcionan cuando se requieren. Enzima Producto # Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Cuál es un buen sustrato de endoglicosidasa? R: Para PNGaseF y Protein Deglycosylation Mix sugerimos Fetuin (NEB #P6042, suministrado con Protein Deglycosylation Mix). Para PNGasaF, Endo H y Endo Hf, sugerimos la ARNasa B (NEB n.° P7817). Para Endo D, sugerimos la Fosfolipasa A de veneno de abeja. Para Endo S, sugerimos la IgG monoclonal de ratón (NEB n.° E8032). Para la O-glicosidasa, sugerimos p-Nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuina puede digerirse con neuraminidasa, y neuraminidasa más O-glicosidasa. Los cambios en el peso molecular tras la eliminación de glicanos pueden observarse mediante SDS-PAGE. P: ¿Inhiben los detergentes las exoglucosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imprescindible añadir NP-40 a una concentración final del 1 % a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibida por SDS; sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de disolventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima mediante la PNGasa F rápida.