New England Biolabs, P0704L, PNGasa F

PNGase F es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todas las Categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Proteómica, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% del carbohidrato de 10 µg de RNasa B desnaturalizada en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Ensayo de definición de unidad: 10 µg de RNasa B se desnaturalizan con tampón desnaturalizante de glicoproteínas 1X (SDS al 0,5 %, DTT 40 mM) a 100 °C durante 10 minutos. Después de la adición de NP-40 y GlycoBuffer 2, se añaden diluciones dobles de PNGase F y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. 1X Tampón desnaturalizante de glicoproteína 0,5 % SDS 40 mM DTT 1X NP-40 1 % NP-40 en MilliQ-H2O Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 2 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 2 Fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA 50 % glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 36 000 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Es PNGase F compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: NEB vende dos versiones de la enzima: PNGasa F (NEB n.° P0704) y PNGasa F (sin glicerol) (NEB n.° P0705). Ambas versiones tienen idéntica actividad, especificidad y concentración. La única diferencia radica en que la PNGasa F se almacena en glicerol al 50 %, mientras que la PNGasa F (sin glicerol) no contiene glicerol en su tampón de almacenamiento. Se recomienda la PNGasa F (sin glicerol) cuando el análisis posterior incluya HPLC o espectrometría de masas, ya que estos instrumentos no toleran el glicerol. El tampón desnaturalizante de glicoproteínas (que contiene SDS y DTT) no es compatible con las aplicaciones de espectrometría de masas y, a menudo, es difícil de eliminar de la reacción. Por lo tanto, recomendamos utilizar PNGasa F (sin glicerol) en condiciones no desnaturalizantes si se utilizarán HPLC o MS para el análisis posterior. Las condiciones no desnaturalizantes suelen requerir más unidades enzimáticas y un mayor tiempo de incubación. P: ¿Qué ocurre con la asparagina después de que la PNGasa elimina el azúcar? R: Dado que la enzima es una glicoamidasa, la asparagina se convierte en ácido aspártico. P: ¿Por qué se degrada mi proteína inmunoprecipitada (IP)? Cuando desnaturalizo y añado SDS, solo veo una mancha o ninguna proteína en mi SDS-PAGE. R: Cuando una proteína se desnaturaliza, es más susceptible a la escisión por proteasas. Por esta razón, se puede usar un cóctel de proteasas que contenga lo siguiente en un protocolo de reacción de PNGasa F: Aprotinina (concentración final de 10 μg/ml) Benzamidina (concentración final de 1 mM) Pepstatina (concentración final de 10 μg/ml) Leupeptina (concentración final de 1 μM) EGTA (concentración final de 1 mM) EDTA (concentración final de 1 mM) PMSF (concentración final de 1 mM) Prepare una solución madre concentrada 1000X de cada inhibidor en agua; excepto Pepstatina que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteína. P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para PNGasa F? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: 1. Combine 1-20 µg de glicoproteína, 1 µl de tampón desnaturalizante de glicoproteína 10X y H2O (si es necesario) para hacer un volumen de reacción total de 10 µl. 2. Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. 3. Prepare un volumen total de reacción de 20 µl añadiendo 2 µl de 10X GlycoBuffer 2, 2 µl de 10% NP40, H2O y 1-2 µl de PNGaseF. 4. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Recomendamos limitar PNGaseF a 1/10 (o menos) del volumen total de reacción para mantener la concentración final de glicerol igual a (o menor que) el 5 %. La reacción se puede escalar linealmente para acomodar grandes cantidades de PNGaseF y volúmenes de reacción mayores. P: ¿Funciona PNGase F en urea? R: PNGase F es estable en urea 2,5 M a 37 °C durante 24 h y aún posee el 40 % de su actividad en urea 5 M1. 1. Maley, F., et al, Anal Biochem, 180, 195-204 (1989) P: ¿Cómo inhibo la PNGasa F? R: El SDS es un excelente inhibidor de la PNGasa F. P: ¿Cuánta PNGasa F debo usar para eliminar mi carbohidrato en condiciones nativas? R: Cuando la proteína no está desnaturalizada, la PNGasa F puede tener dificultades para llegar al sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). A veces, la enzima adicional y los tiempos de incubación prolongados pueden ayudar, pero estos valores son específicos de cada proteína y deben determinarse empíricamente. P: Probé la PNGasa F en mi glicoproteína y no vi la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: ¿Sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido a N u O (unido a un Asn o a un Ser/Thr)? La PNGasa F solo eliminará los carbohidratos unidos a un Asn. La O-glucosidasa de NEB (NEB# P0733) eliminará los carbohidratos enlazados a O del núcleo 1 y 3 unidos a Ser/Thr. Si está seguro de que tiene carbohidratos enlazados a N, asegúrese de desnaturalizar la proteína antes de la desglicosilación. La estructura secundaria y terciaria de las proteínas puede impedir que las endoglicosidasas alcancen su sustrato, lo que hace que la desnaturalización sea un paso crucial para una escisión eficiente. Si no desea desnaturalizar, considere agregar más enzima y tiempos de incubación más largos. Si ha desnaturalizado la proteína, asegúrese de agregar NP-40 (para proteger la PNGasa F del SDS en el paso de desnaturalización). Fuera de estas condiciones de reacción, existe la posibilidad de que el carbohidrato sea resistente a la PNGasa F (un caso poco común). Esto ocurre cuando la N-acetil-glucosamina del núcleo es modificada por una α1-3-fucosa (frecuente en las proteínas vegetales). P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F, Endo H y O-glucosidasa? R: La PNGasa F elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn): alta manosa, híbrida, bi, tri y tetraantenaria. Se recomienda esta enzima si el objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N, independientemente del tipo. La Endo H solo elimina alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Se recomienda esta enzima para determinar con mayor precisión el tipo de glicosilación ligada a N o si se sabe que la proteína tiene un carbohidrato sensible a la Endo H. La O-glucosidasa de NEB eliminará los disacáridos desializados de los núcleos 1 y 3 ligados a O unidos a residuos de Ser/Thr. P: ¿Inhiben los detergentes las exoglucosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imperativo añadir NP-40 a una concentración final del 1 % a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibida por SDS; sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de disolventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima mediante Rapid PNGase F. P: ¿Por qué se han cambiado los tampones de reacción de las enzimas NEB glicosidasas? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir usando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se suministran con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. La actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa se evaluó tanto en su sistema de tampón anterior como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o se observó una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (es decir, tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) aún se suministran cuando se requieren. Producto enzimático n.° Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos completos de carbohidratos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es el generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Cuál es un buen sustrato para endoglicosidasa? R: Para PNGaseF y Protein Deglycosylation Mix, sugerimos Fetuin (NEB #P6042, suministrado con Protein Deglycosylation Mix). Para PNGaseF, Endo H y Endo Hf, sugerimos RNase B (NEB #P7817). Para Endo D, sugerimos Phospholipase A de veneno de abeja. Para Endo S, sugerimos IgG monoclonal de ratón (NEB #E8032). Para la O-glicosidasa, sugerimos p-nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuína puede digerirse con neuraminidasa, o con neuraminidasa y O-glicosidasa. Los cambios en el peso molecular tras la eliminación del glicano pueden observarse mediante SDS-PAGE.