New England Biolabs, P0706L, Remove-iT® PNGasa F

Categorías relacionadas con Remove-iT Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Proteómica, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% de los carbohidratos de 5 μg de ARNasa B desnaturalizada con DTT en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 2 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 2 50 mM Fosfato de sodio (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 41 kDa Condiciones de ensayo unitario 5 µg de ARNasa B se desnaturalizan con 1X DTT a 55 °C durante 10 minutos. Después de la adición de 1X GlycoBuffer 2, se añaden diluciones dobles de Remove-iT PNGase F y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la etiqueta en PNGase F? R: La PNGasa F está marcada con un dominio de unión a quitina (CBD). La etiqueta CBD permite la eliminación de una reacción utilizando perlas de quitina (NEB #S6651) o perlas magnéticas de quitina (NEB #E8036). Nota: no hay un sitio de corte entre la PNGasa F y la etiqueta CBD que permita la eliminación de esta etiqueta de la PNGasa F. P: Intenté desglicosilar mi glicoproteína con Remove-iT® PNGasa F, pero no vi la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: ¿Sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido a N u O (ligado a un Asn o a un Ser/Thr)? Remove-iT® PNGasa F solo eliminará los carbohidratos unidos a un Asn. La O-glicosidasa de NEB (NEB# P0733) eliminará los carbohidratos unidos a O del núcleo 1 y del núcleo 3 unidos a Ser/Thr. Si no está viendo desglicosilación y sabe que su proteína tiene N-glicanos, considere agregar más enzima y usar tiempos de incubación más largos. Si ha elegido desnaturalizar la glicoproteína, asegúrese de agregar NP-40 (para proteger la PNGasa F, Recombinante del SDS en el paso de desnaturalización). Fuera de estas condiciones de reacción existe la posibilidad de que el carbohidrato pueda ser resistente a la PNGasa F, Recombinante (algo poco común). Esto sucede cuando el núcleo de N-acetilglucosamina es modificado por una α1-3Fucosa (que se encuentra a menudo en proteínas de plantas e insectos). P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F y Remove-iT® PNGasa F? R: PNGasa F y Remove-iT® PNGasa F se purifican de la misma fuente con idéntica especificidad. Remove-iT PNGasa F se ha expresado con una etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD) para permitir una fácil eliminación de la enzima de una reacción. La etiqueta no cambia ni altera la especificidad o actividad de la enzima. Si se usan en condiciones desnaturalizantes, PNGase F y Remove-iT® PNGase F tienen la misma concentración unitaria. Sin embargo, Remove-iT® PNGase F se vende con una unidad desnaturalizante modificada (solo DTT, sin SDS) para que sea compatible con la espectrometría de masas. P: ¿Cuál es la diferencia entre Remove-iT® PNGase F y Endo H? R: Remove-iT® PNGase F elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn); alta manosa, híbrida, bi, tri y tetra antenaria. Elegirá esta enzima si su objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. Endo H elimina solo alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Elegiría esta enzima para determinar con mayor precisión el tipo de glicosilación ligada a N, o si sabe que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. P: ¿Cuánta Remove-iT® PNGase F debo usar para eliminar mi carbohidrato en condiciones desnaturalizantes nativas o DTT? R: Cuando la proteína no se desnaturaliza con SDS, Remove-iT® PNGase F tiene que trabajar más para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). Algunas veces la enzima adicional y los tiempos de incubación extendidos pueden ayudar, pero estos valores son específicos para cada proteína y deben determinarse empíricamente. P: ¿Remove-iT® PNGase F funciona en urea? R: PNGase F es estable en urea 2.5 M a 37 °C durante 24 h y aún posee el 40% de su actividad en urea 5 M1. 1. Maley, F., et al, Anal Biochem, 180, 195-204 (1989) P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para Remove-iT® PNGase F? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones de enzima deben determinarse empíricamente para un sustrato particular. Combine 10-20 µg de glicoproteína, 1 µL de DTT 40 mM y H2O (si es necesario para hacer un volumen de reacción total de 10 µL). Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 55 °C durante 10 minutos. Haga un volumen de reacción total de 20 µL agregando 2 µL de 10X GlycoBuffer 2, H2O y 1-5 µL de Remove-iT® PNGase F. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Las reacciones se pueden escalar linealmente para acomodar volúmenes de reacción mayores. P: ¿Cómo elimino Remove-iT® PNGase F de una reacción? R: Remove-iT® PNGase F se puede eliminar de una reacción de desglicosilación utilizando perlas magnéticas de quitina de NEB. Las condiciones de reacción típicas para eliminar 1-5 µL de Remove-iT® PNGase F utilizando perlas magnéticas de quitina son las siguientes: Materiales: Remove-iT® PNGase F (NEB #P0706) Perlas magnéticas de quitina (NEB #E8036) Gradilla de separación magnética (NEB #S1506 o NEB #S1509) Pipetear 50 µl de perlas magnéticas de quitina en un tubo Eppendorf y colocar el tubo Eppendorf en una gradilla de separación magnética. Dejar que el imán atraiga las perlas de quitina, luego pipetear el sobrenadante líquido y desecharlo. Con el tubo Eppendorf en la gradilla de separación magnética, lavar las perlas magnéticas de quitina 2 x 500 µl con 50 mM de formiato de NH₂ a pH 4,4 (o el tampón de su elección). Pipetear el sobrenadante y desecharlo. Añadir la muestra de glicoproteína desglicosilada al tubo Eppendorf con perlas magnéticas de quitina. Agitar la muestra de glicoproteína desglicosilada con las perlas magnéticas de quitina durante 10 minutos a 4 °C. Volver a colocar el tubo Eppendorf en la gradilla de separación magnética y dejar que el imán atraiga las perlas de quitina. Pipetear el... Sobrenadante y conservar. Lavar las perlas magnéticas de quitina 3 x 100 µl con 50 mM de NH₄ formato a pH 4,4 (o el tampón de elección). Pipetear el sobrenadante de cada lavado y conservar. Combinar todos los sobrenadantes de los pasos 5 y 6, ya que estos son la glicoproteína desglicosilada. Analizar la muestra con el método de elección. Nota: La eliminación de Remove-iT® PNGase F de la reacción de desglicosilación se puede aumentar linealmente con volúmenes mayores de perlas magnéticas de quitina. P: ¿Cuál es la capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina utilizadas para eliminar Remove-iT® PNGase F? R: La capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina (NEB n.° E8036) es de aproximadamente 0,4 mg/ml de proteína marcada con CBD. Esta capacidad de unión se calcula en mg de proteína por volumen de lecho de resina. Las perlas magnéticas de quitina son una suspensión 50:50. Por lo tanto, 50 µl de suspensión producirán un volumen de lecho de 25 µl. de resina, suficiente para eliminar de 1 a 5 µL de Remove-iT® PNGase F. P: ¿Es Remove-iT® PNGase F compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: Remove-iT® PNGase F se suministra en un tampón de almacenamiento sin glicerol, compatible con espectrometría de masas. El tampón desnaturalizante de glicoproteínas (que contiene SDS y DTT) no es compatible con aplicaciones de espectrometría de masas y, a menudo, es difícil de eliminar de la reacción. Por lo tanto, la definición de la unidad Remove-iT® PNGase F se basa en un protocolo de desnaturalización parcial que utiliza solo DTT, sin SDS, lo que hace que la reacción sea compatible con análisis posteriores de HPLC y MS. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glycosidase han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir utilizando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglucosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con GlycoBuffer 10X. 1. GlycoBuffer 4 incluye dos excepciones. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. Se evaluó la actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa tanto en su sistema de tampón anterior como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o presentan una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (como el tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) se suministran cuando se requieren. Enzima Producto n.° Tampón anterior Tampón actual ¿Cambiado? α-N-Acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F (Sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Cuál es un buen sustrato para endoglicosidasa? R: Para PNGaseF y Protein Deglycosylation Mix sugerimos Fetuin (NEB #P6042, suministrado con Protein Deglycosylation Mix). Para PNGaseF, Endo H y Endo Hf, sugerimos RNasa B (NEB #P7817). Para Endo D sugerimos Fosfolipasa A de veneno de abeja. Para Endo S sugerimos IgG monoclonal de ratón (NEB #E8032). Para la O-glicosidasa, sugerimos p-nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuina puede digerirse con neuraminidasa, y neuraminidasa más O-glicosidasa. Los cambios en el peso molecular tras la eliminación de glicanos pueden observarse mediante SDS-PAGE. P: ¿Inhiben los detergentes las exoglicosidasas/endoglicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que se inhiben con SDS. Es imprescindible añadir NP-40 a una concentración final del 1 % a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. La endo D también se inhibe con SDS, sin embargo NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de solventes orgánicos, pueden prevenir la desglicosilación rápida óptima por Rapid PNGase F. P: ¿Qué son las glicosidasas y sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Vienen en dos variedades, endoglicosidasas que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas y exoglicosidasas que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es uno generado por una endoglicosidasa. Los investigadores con frecuencia utilizan una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos utilizando SDS-PAGE o varios tipos de cromatografía líquida.