New England Biolabs, P0707S, PNGasa A

PNGasa A escinde entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos de alto contenido en manosa, híbridos y complejos cortos como los que se encuentran en células de plantas e insectos a partir de glicoproteínas y glicopéptidos ligados a N. PNGasa A difiere de PNGasa F en que escinde glicanos ligados a N con o sin residuos de fucosa centrales ligados a α(1,3). Categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Glicobiología y proteómica,, Proteómica, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% del carbohidrato de 1 µg de avidina recombinante desnaturalizada producida en maíz en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 3 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 3 50 mM de acetato de sodio (pH 6 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 63,8 kDa Condiciones de ensayo unitario 1 μg de avidina recombinante se desnaturaliza con 1X Glycoprotein Denaturing Buffer a 100 °C durante 10 minutos. Después de la adición de NP-40 y GlycoBuffer 3, se añaden diluciones dobles de PNGasa A y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F y PNGasa A? A: Tanto la PNGasa F como la PNGasa A escinden entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de los glicanos N-ligados tanto en las glicoproteínas como en los glicopéptidos. La PNGasa F puede escindir casi todos los glicanos N-ligados de oligosacáridos con alto contenido de manosa, híbridos y complejos. Sin embargo, la PNGasa F no puede escindir los N-glicanos con fucosilación α1-3 central. Por el contrario, la PNGasa A escinde los glicanos N-ligados de oligosacáridos con alto contenido de manosa, híbridos y complejos cortos, como los que se encuentran en las células de plantas e insectos. La PNGasa A se diferencia de la PNGasa F en que escinde los glicanos N-ligados con o sin residuos de fucosa central α(1,3)-ligados. P: ¿Puede utilizarse la PNGasa A en condiciones no desnaturalizantes (nativas)? R: No, la PNGasa A requiere que la glicoproteína se reduzca al menos ligeramente antes de la desglicosilación. Recomendamos usar PNGasa A solo con DTT a una concentración final de 40 mM. La reacción debe calentarse a 55 °C durante 10 minutos y luego enfriarse antes de agregar la PNGasa A. Puede ser necesario aumentar la cantidad de PNGasa A o la duración de la incubación a 37 °C para lograr una desglicosilación completa. P: ¿Qué estructuras con alto contenido de manosa puede escindir la PNGasa A? R: La PNGasa A puede escindir estructuras de N-glicano con alto contenido de manosa desde Man 3 hasta Man 9. P: ¿Puede la PNGasa A escindir oligosacáridos grandes y complejos? R: La PNGasa A no puede escindir N-glicanos más grandes, como los de la fetuina, el fibrinógeno, la IgG, la lactoferrina y la transferrina. P: ¿Qué le sucede a la asparagina después de que la PNGasa A elimina el azúcar? R: Dado que la enzima es una glicoamidasa, la asparagina se convierte en ácido aspártico. P: ¿Cuál es un buen sustrato para la PNGasa A? R: La PNGasa A de NEB escinde tanto glicoproteínas como glicopéptidos. Sugerimos usar avidina recombinante de maíz o peroxidasa de rábano picante (HRP) como controles positivos. P: ¿Es la PNGasa A compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: La PNGasa A se suministra en un tampón de almacenamiento sin glicerol para permitir su compatibilidad con análisis posteriores como HPLC o espectrometría de masas, ya que estos instrumentos no toleran el glicerol. El tampón desnaturalizante de glicoproteínas (que contiene SDS y DTT) no es compatible con aplicaciones de espectrometría de masas y, a menudo, es difícil de eliminar de la reacción. Por lo tanto, para crear una reacción compatible con la espectrometría de masas, recomendamos usar la PNGasa A solo con DTT a una concentración final de 40 mM. La reacción debe calentarse a 55 °C durante 10 minutos y luego enfriarse antes de agregar la PNGasa A. Puede ser necesario aumentar la cantidad de PNGasa A o la duración de la incubación a 37 °C para lograr una desglicosilación completa. P: ¿Cuánta PNGasa A debo usar para eliminar mi carbohidrato en condiciones desnaturalizantes nativas o con DTT? R: Cuando la proteína no se desnaturaliza con SDS, la PNGasa A tiene que trabajar más para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). A veces, la enzima adicional y los tiempos de incubación prolongados pueden ayudar, pero estos valores son específicos de cada proteína y deben determinarse empíricamente. P: ¿Por qué se degrada mi proteína? Cuando desnaturalizo y agrego SDS, todo lo que veo en mi SDS-PAGE es una mancha o ninguna proteína. ¿Se puede usar un cóctel de inhibidores de proteasa en una reacción de PNGasa A? R: Cuando una proteína se desnaturaliza, es más susceptible a la escisión por proteasas. Por esta razón, se puede usar un cóctel de proteasas que contenga lo siguiente en un protocolo de reacción de PNGasa A: Aprotinina (concentración final de 10 μg/ml) Benzamidina (concentración final de 1 mM) Pepstatina (concentración final de 10 μg/ml) Leupeptina (concentración final de 1 μM) EGTA (concentración final de 1 mM) EDTA (concentración final de 1 mM) PMSF (concentración final de 1 mM) Prepare una solución madre concentrada 1000X de cada inhibidor en agua; excepto la pepstatina, que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteínas. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Vienen en dos variedades, endoglicosidasas que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas y exoglicosidasas que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida.