New England Biolabs, P0708S, PNGasa F, recombinante

PNGase F es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todas las Categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Proteómica, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% del carbohidrato de 10 μg de RNasa B desnaturalizada en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Ensayo de definición de unidad: 10 µg de RNasa B se desnaturalizan con tampón desnaturalizante de glicoproteínas 1X (SDS al 0,5 %, DTT 40 mM) a 100 °C durante 10 minutos. Después de la adición de NP-40 y GlycoBuffer 2, se añaden diluciones dobles de PNGase F y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. 1X Tampón desnaturalizante de glicoproteína 0,5% SDS 40 mM DTT 1X NP-40 1% NP-40 en MilliQ-H2O Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 2 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 2 Fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 50% glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 36 000 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Existe alguna diferencia entre PNGase F (P0704/P0705) y PNGase F, recombinante (P0708/P0709)? R: La PNGasa F (P0704/P0705) se purifica a partir de Elizabethkingia miricola (anteriormente Flavobacterium meningosepticum). Por otro lado, la PNGasa F recombinante (P0708/P0709) se clona a partir de Elizabethkingia miricola y se expresa en E. coli. No hemos detectado diferencias entre las versiones nativa y recombinante de la PNGasa F. Ambas versiones de la enzima tienen idéntica actividad, especificidad y concentración. P: Intenté desglicosilar mi glicoproteína con Remove-iT® PNGasa F, pero no observé la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: ¿Sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido a N u O (a un Asn o a una Ser/Thr)? Remove-iT® PNGasa F solo eliminará los carbohidratos unidos a un Asn. La O-glicosidasa de NEB (NEB# P0733) eliminará los carbohidratos enlazados a O del núcleo 1 y del núcleo 3 unidos a Ser/Thr. Si no observa desglicosilación y sabe que su proteína contiene N-glicanos, considere agregar más enzima y prolongar los tiempos de incubación. Si ha optado por desnaturalizar la glicoproteína, asegúrese de agregar NP-40 (para proteger la PNGasa F, Recombinante, del SDS en el paso de desnaturalización). Fuera de estas condiciones de reacción, existe la posibilidad de que el carbohidrato sea resistente a la PNGasa F, Recombinante (un caso poco frecuente). Esto ocurre cuando la N-acetilglucosamina del núcleo se modifica con una α1-3-fucosa (frecuente en proteínas de plantas e insectos). P: ¿Qué le sucede a la asparagina después de que la PNGasa elimina el azúcar? R: Dado que la enzima es una glicoamidasa, la asparagina se convierte en ácido aspártico. P: ¿Por qué se degrada la proteína? Cuando desnaturalizo y añado SDS, todo lo que veo en mi SDS-PAGE es una mancha o ninguna proteína. ¿Se puede usar un cóctel de inhibidores de proteasa en una reacción PNGasa F, Recombinante? R: Cuando una proteína se desnaturaliza, es más susceptible a la escisión por proteasas. Por esta razón, se puede usar un cóctel de proteasa que contenga lo siguiente en un protocolo de reacción PNGasa F, Recombinante: Aprotinina (concentración final de 10 μg/ml) Benzamidina (concentración final de 1 mM) Pepstatina (concentración final de 10 μg/ml) Leupeptina (concentración final de 1 μM) EGTA (concentración final de 1 mM) EDTA (concentración final de 1 mM) PMSF (concentración final de 1 mM) Prepare una solución madre concentrada 1000X de cada inhibidor en agua; excepto la Pepstatina, que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glucoproteínas. P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F, Endo H y O-glicosidasa? R: La PNGasa F elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn): alta manosa, híbrida, bi, tri y tetraantenaria. Se elegirá esta enzima si su objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. La Endo H elimina solo alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Se elegiría esta enzima para determinar con mayor precisión el tipo de glicosilación ligada a N, o si se sabe que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. La O-glicosidasa de NEB eliminará los disacáridos desialiados de los núcleos 1 y 3 ligados a O unidos a residuos de Ser/Thr. P: ¿Funciona la PNGasa F en urea? R: La PNGasa F es estable en urea 2,5 M a 37 °C durante 24 h y aún posee el 40 % de su actividad en urea 5 M. 1. Maley, F., et al., Anal Biochem, 180, 195-204 (1989) P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para la PNGasa F, Recombinante? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones enzimáticas deben determinarse empíricamente para un sustrato específico. Combine de 1 a 20 μg de glicoproteína, 1 μl de tampón desnaturalizante de glicoproteína 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 μl. Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. Complete un volumen total de reacción de 20 μl añadiendo 2 μl de tampón de glicoproteína 2 10X, 2 μl de NP40 al 10 %, H₂O y de 1 a 5 μl de PNGasa F, Recombinante. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Las reacciones pueden ampliarse linealmente para adaptarse a volúmenes de reacción mayores. P: ¿Cuánta PNGasa F, Recombinante debo usar para eliminar mi carbohidrato en condiciones de desnaturalización nativas o con DTT? R: Cuando la proteína no se desnaturaliza con SDS, la PNGasa F, Recombinante debe esforzarse más para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). En ocasiones, una enzima adicional y tiempos de incubación prolongados pueden ayudar, pero estos valores son específicos de cada proteína y deben determinarse empíricamente. P: ¿Cómo inhibo la PNGasa F, Recombinante? R: El SDS es un excelente inhibidor de la PNGasa F, Recombinante. P: ¿Es la PNGasa F, Recombinante compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: NEB vende dos versiones de la enzima: PNGasa F, Recombinante (NEB n.° P0708) y PNGasa F (sin glicerol), Recombinante (NEB n.° P0709). Las dos versiones de la enzima tienen idéntica actividad, especificidad y concentración. La única diferencia entre ambas radica en que la PNGasa F, Recombinante, se almacena en glicerol al 50 %, mientras que la PNGasa F (sin glicerol), Recombinante, no contiene glicerol en su tampón de almacenamiento. La PNGasa F (sin glicerol), Recombinante, se recomienda cuando el análisis posterior incluya HPLC o espectrometría de masas, debido a que el glicerol no es tolerado por dichos instrumentos. El tampón desnaturalizante de glicoproteínas (que contiene SDS y DTT) no es compatible con las aplicaciones de espectrometría de masas y, a menudo, es difícil de eliminar de la reacción. Por lo tanto, recomendamos utilizar la PNGasa F (sin glicerol), Recombinante en condiciones no desnaturalizantes si se utilizará HPLC o MS para el análisis posterior. Las condiciones no desnaturalizantes suelen requerir más unidades de enzima y un mayor tiempo de incubación. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Los detergentes inhiben las exoglicosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imperativo agregar NP-40 a una concentración final del 1% a su mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibida por SDS, sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de solventes orgánicos, pueden prevenir la desglicosilación rápida óptima por Rapid PNGase F. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glycosidase han cambiado los tampones de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción y puedo seguir usando una enzima con su tampón antiguo? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones antiguos? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se proporcionan con 10X GlycoBuffer 1. Se proporcionan dos excepciones con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. Se evaluó la actividad de cada enzima endo y exoglucosidasa en sus sistemas de tampón antiguos y nuevos. Todas las enzimas conservaron la misma actividad o mostraron una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglucosidasas se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Al igual que antes, algunas exoglucosidasas se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (como el tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) se suministran cuando se requieren. Enzima: Producto n.° Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Cuál es un buen sustrato de endoglicosidasa? R: Para PNGaseF y Protein Deglycosylation Mix sugerimos Fetuin (NEB #P6042, suministrado con Protein Deglycosylation Mix). Para PNGasaF, Endo H y Endo Hf, sugerimos la ARNasa B (NEB n.° P7817). Para Endo D, sugerimos la Fosfolipasa A de veneno de abeja. Para Endo S, sugerimos la IgG monoclonal de ratón (NEB n.° E8032). Para la O-glicosidasa, sugerimos el p-nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuina puede digerirse con neuraminidasa, y neuraminidasa más O-glicosidasa. Los cambios en el peso molecular tras la eliminación de glicanos pueden observarse mediante SDS-PAGE.