New England Biolabs, P0709L, PNGasa F (sin glicerol), recombinante

PNGase F es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todas las categorías relacionadas Endoglicosidasas, Aplicaciones de análisis de proteomas Glicómica y glicoproteómica, Sistemas de expresión, Secuenciación de glicanos, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% de los carbohidratos de 10 μg de ARNasa B desnaturalizada en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. 1X Tampón desnaturalizante de glicoproteína 0,5% SDS 40 mM DTT 1X NP-40 1% NP-40 en MilliQ-H2O Condiciones de reacción 1X Tampón glicoproteína 2 Incubar a 37 °C 1X Tampón glicoproteína 2 Fosfato sódico 50 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento NaCl 50 mM Tris-HCl 20 mM EDTA 5 mM pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 36000 daltons Condiciones del ensayo unitario Se desnaturalizan 10 μg de ARNasa B con 1X Tampón desnaturalizante de glicoproteína a 100 °C durante 10 minutos. Después de la adición de NP-40 y GlycoBuffer 2, se añaden diluciones dobles de PNGase F (glicerol-free), Recombinant y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza por SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Hay alguna diferencia entre PNGase F (P0704/P0705) y PNGase F, Recombinant (P0708/P0709)? R: PNGase F (P0704/P0705) se purifica de Elizabethkingia miricola (anteriormente Flavobacterium meningosepticum). Mientras que PNGase F, Recombinant (P0708/P0709) se clona de Elizabethkingia miricola y se expresa en E. coli. No hemos detectado diferencias entre las versiones nativa y recombinante de PNGase F. Las dos versiones de la enzima tienen idéntica actividad, especificidad y concentración. P: Intenté desglicosilar mi glicoproteína con Remove-iT® PNGase F, pero no observé la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: ¿Sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido por N u O (a una Asn o a una Ser/Thr)? Remove-iT® PNGase F solo elimina los carbohidratos unidos a una Asn. La O-glicosidasa de NEB (NEB# P0733) elimina los carbohidratos unidos por O del núcleo 1 y el núcleo 3 unidos a Ser/Thr. Si no observa desglicosilación y sabe que su proteína contiene N-glicanos, considere agregar más enzima y usar tiempos de incubación más largos. Si ha optado por desnaturalizar la glicoproteína, asegúrese de agregar NP-40 (para proteger la PNGase F, Recombinant del SDS en el paso de desnaturalización). Fuera de estas condiciones de reacción, existe la posibilidad de que el carbohidrato sea resistente a la PNGase F, Recombinant (algo poco común). Esto ocurre cuando la N-acetilglucosamina central es modificada por una α1-3-fucosa (frecuente en proteínas de plantas e insectos). P: ¿Qué le sucede a la asparagina después de que la PNGasa elimina el azúcar? R: Dado que la enzima es una glicoamidasa, la asparagina se convierte en ácido aspártico. P: ¿Por qué se degrada la proteína? Cuando desnaturalizo y añado SDS, solo veo una mancha en mi SDS-PAGE o ninguna proteína. ¿Se puede usar un cóctel de inhibidores de proteasas en una reacción de PNGasa F recombinante? R: Cuando una proteína se desnaturaliza, es más susceptible a la escisión por proteasas. Por esta razón, se puede usar un cóctel de proteasas que contenga lo siguiente en un protocolo de reacción recombinante de PNGasa F: Aprotinina (concentración final de 10 μg/ml) Benzamidina (concentración final de 1 mM) Pepstatina (concentración final de 10 μg/ml) Leupeptina (concentración final de 1 μM) EGTA (concentración final de 1 mM) EDTA (concentración final de 1 mM) PMSF (concentración final de 1 mM) Prepare un stock concentrado 1000X de cada inhibidor en agua; excepto Pepstatina que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteínas. P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F, Endo H y O-glicosidasa? R: PNGasa F elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn); alta manosa, híbrida, bi, tri y tetraantenaria. Elegirá esta enzima si su objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. Endo H elimina solo altos niveles de manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos N-ligados. Elegirías esta enzima para determinar con más precisión el tipo de glicosilación N-ligada, o si sabes que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. La O-glicosidasa de NEB eliminará los disacáridos desialiados de núcleo 1 y núcleo 3 O-ligados unidos a residuos Ser/Thr. P: ¿Funciona PNGasa F en urea? R: PNGasa F es estable en urea 2,5 M a 37 °C durante 24 h y aún posee el 40 % de su actividad en urea 5 M1. 1. Maley, F., et al, Anal Biochem, 180, 195-204 (1989) P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para PNGasa F, Recombinante? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones de enzimas deben determinarse empíricamente para un sustrato en particular. Combine de 1 a 20 μg de glicoproteína, 1 μl de tampón desnaturalizante de glicoproteína 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 μl. Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. Para obtener un volumen total de reacción de 20 μl, añada 2 μl de tampón de glicoproteína 2 10X, 2 μl de NP40 al 10 %, H₂O y de 1 a 5 μl de PNGasa F recombinante. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Las reacciones se pueden escalar linealmente para dar cabida a volúmenes mayores. P: ¿Cuánta PNGasa F recombinante debo usar para eliminar los carbohidratos en condiciones de desnaturalización nativas o con DTT? R: Cuando la proteína no se desnaturaliza con SDS, la PNGasa F, Recombinante tiene que esforzarse más para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). En ocasiones, una enzima adicional y tiempos de incubación prolongados pueden ayudar, pero estos valores son específicos de cada proteína y deben determinarse empíricamente. P: ¿Cómo inhibo la PNGasa F, Recombinante? R: El SDS es un excelente inhibidor de la PNGasa F, Recombinante. P: ¿Es la PNGasa F, Recombinante compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: NEB vende dos versiones de la enzima, PNGasa F, Recombinante (NEB n.º P0708) y PNGasa F (sin glicerol), Recombinante (NEB n.º P0709). Las dos versiones de la enzima tienen idéntica actividad, especificidad y concentración. La única diferencia entre ambos es que la PNGasa F, Recombinante se almacena en glicerol al 50%, mientras que la PNGasa F (sin glicerol), Recombinante no contiene glicerol en su tampón de almacenamiento. La PNGasa F (sin glicerol), Recombinante se recomienda cuando el análisis posterior incluya HPLC o espectrometría de masas, debido a que el glicerol no es tolerado en dichos instrumentos. El tampón desnaturalizante de glicoproteínas (que contiene SDS y DTT) no es compatible con las aplicaciones de espectrometría de masas y, a menudo, es difícil de eliminar de la reacción. Por lo tanto, recomendamos usar la PNGasa F (sin glicerol), Recombinante en condiciones no desnaturalizantes si se utilizará HPLC o MS para el análisis posterior. Las condiciones no desnaturalizantes suelen requerir más unidades enzimáticas y un mayor tiempo de incubación. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos completos de carbohidratos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Inhiben los detergentes las exoglicosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imprescindible añadir NP-40 a una concentración final del 1 % a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibida por SDS, sin embargo NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de solventes orgánicos, pueden prevenir la desglicosilación rápida óptima por Rapid PNGase F. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glycosidase han cambiado los buffers de reacción? ¿Cuáles son los nuevos buffers de reacción y puedo seguir usando una enzima con su buffer antiguo? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los buffers antiguos? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se proporcionan con 10X GlycoBuffer 1. Se proporcionan dos excepciones con GlycoBuffer 4. Además, el panel de buffer para endoglicosidasas se ha simplificado. La actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa se evaluó tanto en su sistema de buffer antiguo como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o presentan una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglucosidasas se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Al igual que antes, algunas exoglucosidasas se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (como el tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) se suministran cuando se requieren. Enzima Producto n.° Tampón anterior Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Cuál es un buen sustrato de endoglicosidasa? R: Para PNGaseF y Protein Deglycosylation Mix sugerimos Fetuin (NEB #P6042, suministrado con Protein Deglycosylation Mix). Para PNGasaF, Endo H y Endo Hf, sugerimos la ARNasa B (NEB n.° P7817). Para Endo D, sugerimos la Fosfolipasa A de veneno de abeja. Para Endo S, sugerimos la IgG monoclonal de ratón (NEB n.° E8032). Para la O-glicosidasa, sugerimos el p-nitrofenil galacto-N-biósido (Galβ1-3GalNAcα1pNP o Core1-pNP). Como alternativa, la fetuina puede digerirse con neuraminidasa, y neuraminidasa más O-glicosidasa. Los cambios en el peso molecular tras la eliminación de glicanos pueden observarse mediante SDS-PAGE.