New England Biolabs, P0710S, Rapid™ PNGasa F

Rapid PNGase F permite una desglicosilación completa y rápida de anticuerpos y proteínas de fusión de inmunoglobulinas, así como otras glicoproteínas, en minutos. Todas las categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Análisis de anticuerpos y bioterapéuticos,, Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos, Especificación Condiciones de reacción Tampón Rapid PNGase F 1X Incubar a 50 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre Rapid PNGase F y Endo S (Endo S, NEB# P0741)? R: Rapid PNGase F escinde los N-glicanos de los anticuerpos entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina. Endo S es una endoglicosidasa que escinde dentro del núcleo de la quitobiosa los N-glicanos unidos de la cadena pesada de la IgG nativa. Una sola GlcNAc, con un residuo de fucosa si está presente, permanece unida al residuo de asparagina de la cadena de IgG. P: ¿Cuál es la diferencia entre Rapid PNGase F y PNGase F? R: Rapid PNGase F se ha desarrollado para desglicosilar anticuerpos y proteínas de fusión relacionadas en minutos. La práctica configuración y el rápido tiempo de reacción hacen que Rapid PNGase F sea ideal para aplicaciones de alto rendimiento durante el desarrollo y el control de calidad de anticuerpos monoclonales terapéuticos. P: ¿Cuáles son los componentes de Rapid PNGase F? R: Rapid PNGase F se suministra con su propio tampón patentado 5x Rapid PNGase F. P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para Rapid PNGase F? R: Para una transferencia de calor óptima, utilice microtubos de pared fina de 0,2 ml o, alternativamente, tubos de centrífuga de 1,5 ml. Un termociclador con tapa calefactada o un bloque térmico para microtubos son adecuados para la incubación. Las reacciones se pueden escalar linealmente para acomodar mayores cantidades de glicoproteína o volúmenes de reacción mayores. Protocolo de un paso: Combine hasta 100 μg de anticuerpo y H2O en un volumen de 16 μl. Añada 4 μl de tampón 5X Rapid PNGase F para obtener un volumen de reacción total de 20 μl. Añada 1 μl de Rapid PNGase F. Incube 10 minutos a 50 °C. Prepare los N-glicanos para la derivatización (es decir, la aminación reductora) para el análisis posterior. Para preparar una proteína desglicosilada para el análisis por espectrometría de masas, intercambie el tampón mediante microdiálisis o microfiltración. Consulte "Glicoproteómica: Protocolos de intercambio de tampón" para obtener más detalles. Protocolo de dos pasos: Algunos anticuerpos (es decir, los N-glicanos Fab) requieren un paso de precalentamiento para una desglicosilación eficiente. Combine hasta 100 μg de anticuerpo y H2O en un volumen de 16 μl. Añada 4 μl de tampón 5X Rapid PNGase F para obtener un volumen de reacción total de 20 μl. Incube a 80 °C durante 2 minutos y enfríe. Añada 1 μl de Rapid PNGase F. Incube 10 minutos a 50 °C. Prepare los N-glicanos para la derivatización (es decir, la aminación reductora) para el análisis posterior. Para preparar una proteína desglicosilada para el análisis por espectrometría de masas, intercambie el tampón mediante microdiálisis o microfiltración. Consulte “Glicoproteómica: Protocolos de intercambio de tampón” para obtener más detalles. P: ¿Cómo sé si debo seguir el protocolo de “un paso” o de “dos pasos”? R: Rapid PNGase F se ha desarrollado para una desglicosilación rápida y eficiente de anticuerpos en una simple reacción de un solo paso a 50 °C. Sin embargo, algunas IgG (es decir, las que llevan la glicosilación de Fab) requieren un paso de desnaturalización previa de 2 minutos a 80 °C. Recomendamos comenzar con el protocolo estándar de un paso. Si hay evidencia (es decir, por migración en gel o análisis proteómico) de que los N-glicanos permanecen unidos a la proteína, siga el protocolo de dos pasos. P: ¿Cuánta Rapid PNGase F debo usar para desglicosilar mi muestra de anticuerpos? R: La cantidad de enzima recomendada es suficiente para la desglicosilación de hasta 100 μg de un anticuerpo monoclonal de ratón de isotipo IgG2a. La cantidad óptima de material de partida estará determinada por la naturaleza de la muestra (diversidad de glicanos) y el análisis particular de N-glicanos que se realizará posteriormente. Típicamente, 30-50 µg de anticuerpo son suficientes para la cuantificación completa de N-glicanos (después del marcaje por aminación reductora) por HILIC seguido de ESI-MS. Para proteínas con sitios de glicano adicionales y/o una alta variabilidad de glicosilación, podría requerirse más material de partida para cuantificar todas las especies de glicanos menores. Las reacciones pueden escalarse linealmente para acomodar mayores cantidades de glicoproteína o volúmenes de reacción mayores. P: ¿Qué tampones o aditivos deben evitarse al usar Rapid PNGase F? R: La proteína diana debe estar en una solución compatible con la actividad de Rapid PNGase F. Evite los tampones que contengan SDS, ya que inhibe la PNGase F. Los reactivos estabilizadores comunes, como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como las trazas de disolventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima. P: ¿Cómo puedo comprobar si la reacción de Rapid PNGase F se completa en 10 minutos? R: En el caso de un anticuerpo monoclonal, se puede observar un desplazamiento en la SDS-PAGE tras la eliminación de los N-glicanos. Normalmente, este es solo un cambio modesto, por lo que es crucial analizar un control junto con la muestra real para comparar la posición en un gel y determinar si la desglicosilación es parcial o completa (consulte el protocolo "Análisis de una reacción de desglicosilación rápida de PNGasa F mediante SDS-PAGE"). Para detectar si quedan pequeñas cantidades de anticuerpo glicosilado, se requiere un ensayo más sensible. Por ejemplo, un análisis proteómico mediante LS-ESI-TOF mostrará las diferentes formas glicosiladas y no glicosiladas presentes (consulte el "Protocolo LS-ESI-TOF para proteínas intactas"). P: ¿Son compatibles los análisis posteriores, como la HPLC y la espectrometría de masas, con la PNGasa F rápida? R: Sí, para preparar muestras para cromatografía líquida o espectrometría de masas, los N-glicanos se pueden aislar mediante métodos convencionales de extracción en fase sólida, como C18 y carbón grafitizado (PGC). Consulte los "Protocolos de SPE de glicanos C18 y carbón grafitizado". Además de C18 y PGC, también se puede utilizar la interacción hidrófila (HILIC) posteriormente. Para un experimento de proteómica, el anticuerpo diana se puede preparar mediante microdiálisis o microfiltración (consulte "Glicoproteómica: Protocolos de intercambio de tampón"). P: ¿Es Rapid PNGase F solo adecuada para la desglicosilación de anticuerpos? R: Aunque este producto se ha optimizado para la eliminación rápida de N-glicanos de los anticuerpos, puede utilizarse con otras glicoproteínas. Se ha demostrado que Rapid PNGase F actúa sobre otras proteínas como el fibrinógeno y la transferrina. Sin embargo, algunas proteínas analizadas, como la fetuina, no se desglicosilaron eficazmente con Rapid PNGase F en 10 minutos. P: ¿Son los tiempos de incubación más prolongados perjudiciales para la reacción de Rapid PNGase F? R: No. Se obtuvieron resultados idénticos (rendimientos cuantitativos y cualitativos de N-glicanos liberados, así como análisis intacto del anticuerpo desglicosilado) tras un período de incubación de 10 minutos o 1 hora. P: ¿Cuál es el rango de temperatura de reacción para Rapid PNGase F? R: Utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón, se observó una desglicosilación efectiva en 10 minutos a una temperatura de entre 48 y 58 °C. La temperatura óptima para el uso de Rapid PNGase F es de 50 °C. P: ¿Qué sucede con el residuo de asparagina después de que Rapid PNGase F elimina el azúcar? R: Dado que la enzima es una glicoamidasa, el residuo de asparagina se convierte en ácido aspártico. P: ¿Una reacción de Rapid PNGase F preservará la integridad de las glicosilaminas? R: No. Aunque Rapid PNGase F libera N-glicanos como glicosilaminas, el grupo amino es inestable y se convierte rápidamente. La reacción de desglicosilación da como resultado N-glicanos con un extremo reductor libre. P: ¿Se puede utilizar un cóctel de inhibidores de proteasas en una reacción de Rapid PNGase F? R: Sí. Los cócteles de proteasas son compatibles con la reacción de Rapid PNGase F. Se han probado los siguientes inhibidores de la proteasa: aprotinina (concentración final de 10 μg/ml), benzamidina (concentración final de 1 mM), pepstatina (concentración final de 10 μg/ml), leupeptina (concentración final de 1 μM), EGTA (concentración final de 1 mM), EDTA (concentración final de 1 mM) y PMSF (concentración final de 1 mM). Tenga en cuenta que no recomendamos el PMSF, ya que puede modificar los residuos básicos de los sustratos de glicoproteínas. P: ¿Cuál es un buen sustrato de control para Rapid PNGase F? R: Estándar de anticuerpos Rapid PNGase F, NEB n.° P6043. El estándar de anticuerpos Rapid PNGase F es un anticuerpo monoclonal murino anti-MBP, isotipo IgG2a.