New England Biolabs, P0711S, Rapid™ PNGase F (formato no reductor)

Categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Análisis de anticuerpos y bioterapéuticos,, Sistemas de expresión,, Proteómica, Especificación Condiciones de reacción Tampón 1X Rapid PNGase F (formato no reductor) Incubar a 50 °C Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 50 mM EDTA 5 mM pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre Rapid PNGase F y Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: Las condiciones de reacción de Rapid PNGase F (formato no reductor) preservan la integridad de los enlaces disulfuro, lo que lo convierte en el reactivo de elección para estudios de espectrometría de masas de proteínas multiméricas desglicosiladas intactas (es decir, anticuerpos). Mientras que Rapid PNGase F (NEB n.º P0710) es ideal para aplicaciones de análisis y perfilado de N-glicano posteriores. Además, Rapid PNGase F (formato no reductor) sigue un protocolo de 2 pasos, ya que requiere una preincubación estricta a 75 °C. P: ¿Cuál es la diferencia entre Rapid PNGase F (formato no reductor) y Endo S (Endo S, NEB# P0741)? R: Rapid PNGase F (formato no reductor) escinde los N-glicanos de los anticuerpos entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina. Endo S es una endoglicosidasa que escinde dentro del núcleo de la quitobiosa los N-glicanos de la cadena pesada de la IgG nativa. Con Endo S, una sola GlcNAc, con un residuo de fucosa si está presente, permanece unida al residuo de asparagina de la cadena de IgG. P: ¿Cuáles son los componentes de Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: Rapid PNGase F (formato no reductor) se suministra con un tampón patentado 5X Rapid PNGase F (formato no reductor) (NEB# B0717S) para una desglicosilación rápida en condiciones no reductoras. P: ¿Cuánta muestra de anticuerpo se puede desglicosilar con Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: 1 µL de Rapid PNGase F (formato no reductor) en un volumen total de reacción de 10 µL es óptimo para la desglicosilación rápida de hasta 10 µg de anticuerpos con glicosilación de Fc y Fab (como Cetuximab), 15 µg de un anticuerpo monoclonal de ratón de isotipo IgG2a y 30 µg de anticuerpos menos complejos, como Rituximab. Las reacciones se pueden aumentar linealmente para acomodar mayores cantidades de anticuerpo o glicoproteína. P: ¿Cuál es un buen sustrato de control para Rapid PNGase F? A: Estándar de anticuerpos Rapid PNGase F, NEB n.° P6043. El estándar de anticuerpos Rapid PNGase F es un anticuerpo monoclonal murino anti-MBP, isotipo IgG2a. P: ¿Qué debo hacer si mi proteína diana solo está parcialmente desglicosilada con Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: La cantidad de tampón Rapid PNGase F (formato no reductor) se puede aumentar hasta 4 µl en un volumen total de 10 µl para facilitar la eliminación de glicanos en sustratos complejos. Para algunas proteínas (por ejemplo, fetuina o gonadotropina coriónica), los agentes reductores son estrictamente necesarios y la desglicosilación rápida completa en condiciones no reductoras no será posible. En tales casos, recomendamos el uso de Rapid PNGase F (NEB n.° P0710). P: ¿Qué tampones o aditivos se deben evitar al usar Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: La proteína diana debe estar en una solución compatible con la actividad de Rapid PNGase F (formato no reductor). Evite los tampones que contienen SDS, ya que inhibe todas las versiones de la PNGasa F. Los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como las trazas de disolventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima. P: ¿Cómo puedo comprobar si la reacción rápida de PNGasa F (formato no reductor) se completa en 10 minutos? R: En el caso de un anticuerpo monoclonal, se puede observar un desplazamiento en la SDS-PAGE tras la eliminación de los N-glicanos. Normalmente, se trata de un cambio leve, por lo que es fundamental analizar un control junto con la muestra real para comparar la posición en un gel y determinar si la desglicosilación es parcial o completa (consulte el protocolo "SDS-PAGE"). Para detectar si quedan pequeñas cantidades de anticuerpo glicosilado, se requiere un ensayo más sensible. Por ejemplo, un análisis proteómico por LS-ESI-TOF mostrará las diferentes formas glicosiladas y no glicosiladas presentes. P: ¿Es Rapid PNGase F (formato no reductor) compatible con el análisis posterior por espectrometría de masas? R: Sí, para preparar muestras para espectrometría de masas, la proteína diana se puede preparar mediante microdiálisis o microfiltración (consulte “Glicoproteómica: Protocolos de intercambio de tampón”). P: ¿Es Rapid PNGase F (formato no reductor) solo adecuado para la desglicosilación de anticuerpos? R: Aunque este producto se ha optimizado para la eliminación rápida de N-glicanos de los anticuerpos, se puede utilizar con varias otras glicoproteínas. Se ha demostrado que Rapid PNGase F (formato no reductor) actúa sobre otras proteínas como el fibrinógeno y la transferrina. Sin embargo, algunas proteínas analizadas, como la fetuina, no se desglicosilaron eficazmente con Rapid PNGase F (formato no reductor) en 10 minutos. P: ¿Son los tiempos de incubación más largos perjudiciales para la reacción Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: No. Se obtuvieron resultados idénticos (rendimientos cuantitativos y cualitativos de N-glicanos liberados, así como análisis intacto del anticuerpo desglicosilado) después de un período de incubación de 10 minutos o 1 hora. P: ¿Cuál es el rango de temperatura de reacción para Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: Usando el Estándar de Anticuerpos Rapid PNGase F (NEB #P6043), que es un anticuerpo monoclonal murino anti-MBP, isotipo IgG2a, se observó una desglicosilación efectiva en 10 minutos a una temperatura que osciló entre 48 y 58 °C. La temperatura óptima para el uso de Rapid PNGase F (formato no reductor) es de 50 °C. P: ¿Qué sucede con el residuo de asparagina después de que Rapid PNGase F elimina el azúcar? R: Dado que la enzima es una glicoamidasa, el residuo de asparagina se convierte en ácido aspártico. P: ¿Se puede utilizar un cóctel de inhibidores de proteasa en una reacción Rapid PNGase F (formato no reductor)? R: Sí. Los cócteles de proteasa son compatibles con la reacción Rapid PNGase F (formato no reductor). Se han probado los siguientes inhibidores de proteasa: aprotinina (concentración final de 10 μg/ml), benzamidina (concentración final de 1 mM), pepstatina (concentración final de 10 μg/ml), leupeptina (concentración final de 1 μM), EGTA (concentración final de 1 mM), EDTA (concentración final de 1 mM) y PMSF (concentración final de 1 mM). Tenga en cuenta que no recomendamos el PMSF, ya que puede modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteína. P: ¿Es la reacción Rapid PNGase F (formato no reductor) compatible con Trypsin-ultra™ (NEB# P8101)? R: Sí, Trypsin-ultra™ Grado Espectrométrico de Masas (NEB# P8101) puede añadirse directamente a muestras digeridas con Rapid PNGase F (formato no reductor). Protocolo: A una reacción de 10 µl de Rapid PNGase F (formato no reductor) que contenga 10 µg de anticuerpo, añadir 200 µg de Trypsin-ultra™ Grado Espectrométrico de Masas (NEB# P8101) para obtener una relación tripsina/anticuerpo de 1:50. Incubar a 37 °C durante 2 h (nota: los diferentes sustratos pueden requerir diferentes cantidades de tripsina y tiempos de incubación optimizados). Se recomiendan métodos de extracción hidrofílica para aislar péptidos después de una reacción de Rapid PNGase F (formato no reductor)/tripsina.