New England Biolabs, P0720S, α2-3,6,8-neuraminidasa

Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% del α-Neu5Ac terminal de 1 nmol Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-amino-4-metil- cumarina (AMC), en 5 minutos a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 5 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 43 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de α2-3,6,8 neuraminidasa con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 1 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 5 minutos. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina (3). Preguntas frecuentes : P: ¿Puedo usar la α2-3,6,8-neuraminidasa en una digestión doble con Endo H(Hf) o PNGasa F? R: Sí. Al igual que en la pregunta anterior, hemos observado una excelente actividad de la α2-3,6,8-neuraminidasa a pH altos y bajos, y también hemos comprobado su eficacia en proteínas desnaturalizadas. La neuraminidasa muestra una actividad normal incluso en presencia de un 1 % de BME y un 0,5 % de SDS. P: ¿Es activa la α2-3,6,8-neuraminidasa a pH altos? R: Sí. La α2-3,6,8-neuraminidasa tiene una curva de pH muy amplia. Aunque el pH óptimo ronda los 5,5, observamos una excelente eliminación del ácido siálico a pH desde 4,5 hasta 8,5. Hemos utilizado α2-3,6,8 Neuraminidasa en rangos de pH más adecuados para PNGasa F (rango de pH 7,5-8,6). P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía cuando se utilizan diferentes sustratos. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún hay material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche. P: ¿Los detergentes inhiben las exoglucosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imperativo agregar NP-40 a una concentración final del 1% a su mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibido por SDS, sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de solventes orgánicos, pueden prevenir la desglicosilación rápida óptima por Rapid PNGase F. P: ¿Cuál es un buen control positivo para α2-3,6,8 Neuraminidasa? R: Sugerimos Fetuin (NEB #P6042). Los cambios en el peso molecular de fetuin después de la eliminación de glicano se pueden observar por SDS-PAGE. Alternativamente, se puede usar el sustrato cromogénico ácido pNP-N-acetil-neuramínico para la visualización del peso molecular. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glycosidase han cambiado los buffers de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir usando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se suministran con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. La actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa se evaluó tanto en su sistema de tampón anterior como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o se observó una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (es decir, tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) aún se suministran cuando se requieren. Producto enzimático n.° Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos completos de carbohidratos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Es necesario tratar mi glucoproteína concomitantemente con neuraminidasa y O-glucosidasa? R: Sí. Es necesario eliminar los residuos de ácido neuramínico para que la O-glucosidasa escinda los disacáridos O-ligados. Una neuraminidasa general (NEB n.° P0720) funciona bien. Además, está disponible un paquete de O-glucosidasa y neuraminidasa (NEB n.° E0540S). P: ¿Las enzimas NEB Neuraminidasa escinden residuos de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc)? R: Dependiendo de la fuente y la especificidad de la enzima, algunas neuraminidasas escinden tanto Neu5Ac como Neu5Gc, mientras que otras escinden solo Neu5Ac. Las que escinden tanto Neu5Ac como Neu5Gc tienden a tener una menor eficiencia hacia Neu5Gc. NEB# P0720 (Neuraminidasa a2-3,6,8): escinde tanto Neu5Ac como Neu5Gc. NEB# P0722 (Neuraminidasa a2-3,6,8,9): escinde tanto Neu5Ac como Neu5Gc. NEB# P0743 (Neuraminidasa a2-3 S): escinde solo Neu5Ac.