New England Biolabs, P0722S, α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A

La α2-3,6,8,9 neuraminidasa A es una sialidasa de amplia especificidad que escinde residuos de ácido siálico terminales no reductores, lineales y ramificados, de glicoproteínas, glicopéptidos y oligosacáridos. Puede utilizarse para el análisis y la caracterización de glicanos y la remodelación de glicoproteínas intactas. Categorías relacionadas : Exoglucosidasas, Aplicaciones de análisis del proteoma, Sistemas de expresión, Secuenciación de glicanos, Proteómica. Definición de la unidad de especificación : Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% del α-Neu5Ac terminal de 1 nmol de Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-AMC, en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular Aparente: 100 kDa Actividad específica 316.000 unidades/mg Unidad Condiciones del ensayo Se incuban diluciones dobles de α2- 3,6,8,9 Neuraminidasa A con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 1 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía de capa fina (2). Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre las cuatro enzimas neuraminidasas que vende NEB: α2-3,6,8-neuraminidasa, α2-3,6,8,9-neuraminidasa A, α2-3-neuraminidasa y α2-3-neuraminidasa S? R: La α2-3,6,8-neuraminidasa (NEB# P0720) se clona a partir de Clostridium perfringens y escinde residuos de ácido siálico enlazados a α2-3, α2-6 y α2-8. La α2-3,6,8,9-neuraminidasa A (NEB# P0722) se clona a partir de Arthrobacter ureafaciens y escinde residuos de ácido siálico enlazados a α2-3, α2-6, α2-8 y α2-9. También puede escindir residuos de ácido siálico ramificados que están unidos a un residuo interno. La α2-3 Neuraminidasa (NEB# P0728) se clona a partir de Salmonella typhimurium LT2 y escinde residuos de ácido siálico unidos a α2-3. La α2-3 Neuraminidasa S (NEB# P0743) se clona a partir de Streptococcus pneumoniae y escinde residuos de ácido siálico unidos a α2-3. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A? R: Fetuina (NEB# P6042) o ácido pNP-N-acetil-neuramínico. P: ¿Puedo usar la α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A en una digestión doble con otras exoglucosidasas o endoglicosidasas? R: Sí. Recomendamos realizar una doble digestión de la α2-3,6,8,9-neuraminidasa A con otras exoglucosidasas utilizando GlycoBuffer 1 1X (50 mM de acetato de sodio, pH 5,5, 5 mM de CaCl₂). Recomendamos utilizar el tampón de reacción G7 1X (50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5) para la digestión de la α2-3,6,8,9-neuraminidasa A con PNGasa F y/o O-glucosidasa. P: ¿Puedo utilizar la α2-3,6,8,9-neuraminidasa A en una doble digestión con Endo H/Hf, O-glucosidasa o PNGasa F? R: Sí. La α2-3,6,8,9-neuraminidasa A presenta actividad en un amplio rango de pH y se ha demostrado que funciona bien en proteínas desnaturalizadas. La neuraminidasa muestra una actividad normal incluso en presencia de 1% de BME y 0,5% de SDS. P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglicosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se orientan en dirección opuesta a la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad de la enzima. La digestión de algunas proteínas con exoglicosidasa requerirá tiempos de incubación más largos o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glicopéptido después del tratamiento con exoglicosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Los detergentes inhiben las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0% de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F Recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-Glicosidasa, que son inhibidas por SDS. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Las enzimas NEB Neuraminidasa escinden residuos de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc)? R: Dependiendo de la fuente de la enzima y la especificidad, algunas neuraminidasas escinden tanto Neu5Ac como Neu5Gc, mientras que otras escinden solo Neu5Ac. Aquellas que escinden tanto Neu5Ac como Neu5Gc, tienden a tener una menor eficiencia hacia Neu5Gc. NEB# P0720 (a2-3,6,8 Neuraminidasa): escinde tanto Neu5Ac como Neu5Gc NEB# P0722 (a2-3,6,8,9 Neuraminidasa A): escinde tanto Neu5Ac como Neu5Gc NEB# P0743 (a2-3 Neuraminidasa S): escinde solo Neu5Ac P: ¿Es necesario tratar mi glucoproteína concomitantemente con neuraminidasa y O-glucosidasa? R: Sí. Los residuos de ácido neuramínico deben eliminarse para permitir que la O-glucosidasa escinda los disacáridos O-ligados. Una neuraminidasa general (NEB n.° P0720) funciona bien. Además, está disponible un paquete de O-glucosidasa y neuraminidasa (NEB n.° E0540S). P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía según el sustrato. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún queda material sin digerir, deje que la reacción se desarrolle durante la noche.