New England Biolabs, P0733L, O-glucosidasa

La O-glucosidasa, también conocida como endo-α-N-acetilgalactosaminidasa, cataliza la eliminación de los disacáridos O-enlazados Core 1 y Core 3 de las glicoproteínas. Categorías relacionadas: Endoglicosidasas, Aplicaciones del análisis del proteoma, Sistemas de expresión, Secuenciación de glicanos, Digestión de proteínas, Definición de la unidad de especificación : Una unidad de enzima escinde 1 pmol de O-glucopéptido marcado con FAM tratado con neuraminidasa en una hora a 37 °C. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 2 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 2 Fosfato sódico 50 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 50 mM EDTA 1 mM pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 147 kDa Condiciones del ensayo unitario Se añaden diluciones seriadas al doble de O-glicosidasa a mezclas de reacción de 2 pmol de O-glicopéptido marcado con FAM tratado con neuraminidasa en 1X GlycoBuffer 2. Las reacciones se incuban a 37 °C durante 1 hora. La cantidad de O-glicopéptido desglicosilado se determina mediante electroforesis capilar. Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para la O-glicosidasa? R: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones enzimáticas deben determinarse empíricamente para cada sustrato. Las condiciones típicas de reacción son las siguientes: combinar 10-20 µg de glicoproteína, 1 µl de tampón desnaturalizante de glicoproteína 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 µl. Desnaturalizar la glicoproteína calentando la reacción a 100 °C durante 10 minutos. Completar un volumen total de reacción de 20 µl añadiendo 2 µl de tampón de glicoproteína 2 10X, 2 µl de NP-40 al 10 %, 2 µl de neuraminidasa, H₂O y 1-5 µl de O-glicosidasa. Incubar la reacción a 37 °C durante 1-4 horas. Nota: La O-glicosidasa puede utilizarse tanto en condiciones desnaturalizantes como en condiciones nativas. Sin embargo, en condiciones desnaturalizantes, la actividad enzimática se duplica. Esta observación depende del sustrato. La reacción puede aumentarse linealmente para acomodar grandes cantidades de O-glucosidasa y volúmenes de reacción mayores. P: Intenté usar O-glucosidasa en mi glucoproteína y no observé la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: ¿Sabe cómo se une el carbohidrato a la proteína? ¿Está unido por N u O (ligado a una Asn o a una Ser/Thr)? La PNGasa F solo eliminará los carbohidratos unidos a una Asn. La O-glucosidasa eliminará los disacáridos unidos por O del núcleo 1 y del núcleo 3 unidos a Ser/Thr. Si está seguro de que tiene carbohidratos unidos por O, asegúrese de haber tratado su glucoproteína con neuraminidasa y desnaturalizado la proteína antes de la desglucosilación. La estructura secundaria y terciaria de las proteínas puede impedir que las endoglicosidasas alcancen su sustrato, lo que convierte la desnaturalización en un paso crucial para una escisión eficiente. Si no desea desnaturalizar, considere agregar más enzima y tiempos de incubación más largos. Si ha desnaturalizado la proteína, asegúrese de agregar NP-40 (para proteger la O-glucosidasa del SDS en el paso de desnaturalización). P: ¿Cuánta O-glucosidasa debo usar para eliminar mi carbohidrato en condiciones nativas? R: Cuando la proteína no está desnaturalizada, la O-glucosidasa puede tener dificultades para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). En ocasiones, agregar enzima adicional y tiempos de incubación más largos pueden ser útiles, pero estos valores son específicos de cada proteína y deben determinarse empíricamente. P: ¿Los detergentes inhiben la O-glucosidasa? R: Es imperativo agregar NP-40 a una concentración final del 1% a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. La O-glucosidasa presenta una actividad completa en presencia de NP-40 al 1%. P: ¿Se puede usar la neuraminidasa en una digestión con PNGasa F y O-glucosidasa? R: Sí. Se han determinado las condiciones (Pregunta frecuente n.° 1) que permiten el uso de la O-glucosidasa en las mismas condiciones de desnaturalización que la PNGasa F. La PNGasa F y la O-glucosidasa pueden usarse simultáneamente en una reacción con tampón de reacción G7 1X, NP-40 al 10 %, neuraminidasa, H₂O y la glucoproteína. La neuraminidasa tiene un amplio rango de pH y es activa entre 4,5 y 8,5. Funciona muy bien en proteínas desnaturalizadas, y muestra una actividad normal incluso en presencia de BME al 1 % y SDS al 0,5 %. P: ¿Puedo realizar una doble digestión con PNGasa F y O-glucosidasa? R: Sí. Siguiendo las condiciones de reacción listadas en la FAQ #3, puede ver que las condiciones se han determinado que permiten que la O-glicosidasa se use bajo las mismas condiciones de desnaturalización usadas para la PNGasa F. La PNGasa F y la O-glicosidasa se pueden usar concomitantemente en una reacción con 1X G7 Reaction Buffer, 10% NP40, Neuraminidasa, H2O y su glicoproteína. P: ¿Cuál es la diferencia entre la PNGasa F, Endo H y la O-glicosidasa? R: La PNGasa F elimina todos los tipos de glicosilación ligada a N (ligada a Asn); alta manosa, híbrida, bi, tri y tetraantenaria. Elegirá esta enzima si su objetivo es eliminar todos los carbohidratos ligados a N sin importar el tipo. Endo H elimina solo la alta manosa y algunos tipos híbridos de carbohidratos ligados a N. Elegirías esta enzima para determinar con mayor precisión el tipo de glicosilación ligada a N, o si sabes que la proteína tiene un carbohidrato sensible a Endo H. La O-glucosidasa de NEB eliminará los disacáridos desialiados del núcleo 1 y del núcleo 3 O-ligados unidos a residuos Ser/Thr. P: ¿Por qué las enzimas glicosidasas de NEB han cambiado los tampones de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción y puedo seguir usando una enzima con su tampón antiguo? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones antiguos? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglucosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se proporcionan con 10X GlycoBuffer 1. Se proporcionan dos excepciones con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. La actividad de cada enzima endo y exoglucosidasa se evaluó tanto en su sistema de tampón antiguo como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o se encontró que tenían una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglucosidasas aún se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglucosidasas aún se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (como el tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) se suministran cuando se requieren. Enzima Producto n.° Tampón anterior Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos completos de carbohidratos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Es necesario tratar mi glucoproteína concomitantemente con neuraminidasa y O-glucosidasa? R: Sí. Es necesario eliminar los residuos de ácido neuramínico para que la O-glucosidasa escinda los disacáridos O-ligados. Una neuraminidasa general (NEB n.° P0720) funciona bien. Además, está disponible un paquete de O-glucosidasa y neuraminidasa (NEB n.° E0540S). P: ¿Cómo inhibo la O-glucosidasa? R: El SDS inhibe la O-glicosidasa. P: ¿Tiene la O-glicosidasa una etiqueta de purificación por afinidad? R: Sí, la O-glicosidasa contiene una etiqueta de hexahistidina en el extremo C-terminal (etiqueta 6xHis).