New England Biolabs, P0734S, α-N-acetilgalactosaminidasa

La α-N-acetilgalactosaminidasa es una exoglucosidasa que cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores de α-N-acetilgalactosamina de oligosacáridos y N-glicanos unidos a proteínas. Categorías relacionadas Exoglucosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Secuenciación de glicanos,, Expresión de glucoproteínas recombinantes,, Análisis de glucoproteínas Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la α-D- N -acetilgalactosamina terminal de 1 nmol (GalNAcα1-3)(Fucα1-2)Galβ1-4Glc-7-amino-4-metil-cumarina (AMC), en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 suplementado con 100 µg/ml de albúmina recombinante (bajo contenido de glicerol) Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 47 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de α- N -acetilgalactosamininidasa con 1 nmol de sustrato marcado con AMC en 1X GlycoBuffer 1, suplementado con 100 µg/ml de rHSA, en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina (1). Preguntas frecuentes P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía según el sustrato. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún queda material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la α-N-acetilgalactosaminidasa? R: El p-nitrofenil-α-DN-acetilgalactosaminopiranósido (pNP-GalNAc) es un sustrato para esta enzima. P: ¿Los detergentes inhiben las exoglucosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imperativo añadir NP-40 a una concentración final del 1 % a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. Endo D también es inhibida por SDS; sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de disolventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima por Rapid PNGase F. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glicosidasas han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir utilizando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo consultar la composición de los tampones anteriores? A: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se proporcionan con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se proporcionan con GlycoBuffer 4. Además, el panel de tampones para endoglicosidasas se ha simplificado. La actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa se evaluó tanto en su sistema de tampón antiguo como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o se encontró que tenían una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas todavía se proporcionan con un vial adicional de rHSA (rHSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas todavía se proporcionan con un vial adicional de BSA (BSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (es decir, tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) todavía se proporcionan cuando se requieren. Enzima Producto # Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambió? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer