Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, P0741L, Endo S

Endo S es una endoglicosidasa específica para escindir los glicanos unidos a N del núcleo de la quitobiosa de la cadena pesada de la IgG nativa Categorías relacionadas Endoglicosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Análisis de anticuerpos y bioterapéuticos,, Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% de los carbohidratos de 5 μg de IgG monoclonal de ratón nativa en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 55 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 136 kDa Condiciones de ensayo unitario 5 µg de IgG en 1X GlycoBuffer 1 se incuban con diluciones dobles de Endo S durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Endo S está marcado? R: Endo S está marcado con un dominio de unión a quitina (CBD). La etiqueta CBD permite la eliminación de una reacción utilizando perlas de quitina (NEB #S6651) o perlas magnéticas de quitina (NEB #E8036). Nota: no hay un sitio de corte entre Endo S y la etiqueta CBD que permita la eliminación de esta etiqueta de Endo S. P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGase F y Endo S? R: PNGase F corta entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos híbridos, complejos y con alto contenido de manosa de glicoproteínas ligadas a N. Mientras que Endo S tiene una alta especificidad para eliminar glicanos ligados a N dentro del núcleo de quitobiosa de la IgG nativa. P: ¿Cuánto Endo S debo usar para desglicosilar una glicoproteína en condiciones nativas? R: Cuando se trabaja con IgG nativa, recomendamos usar 1 µL de Endo S por cada 100 µg de IgG nativa. Al trabajar con otras glicoproteínas diferentes (como Fetuin) recomendamos utilizar un protocolo de desnaturalización modificado, que se detalla a continuación. Combine 100 µg de glicoproteína, 1 µL de DTT 400 mM y H2O (si es necesario para hacer un volumen de reacción total de 10 µL). Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 55 °C durante 10 minutos. Haga un volumen de reacción total de 20 µL agregando 2 µL de 10X GlycoBuffer 1, H2O y 1-2 µL de Endo S. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Para desglicosilar varias glicoproteínas, pueden requerirse tiempos de incubación más largos y más enzima. Las reacciones pueden escalarse linealmente para acomodar volúmenes de reacción más grandes. P: ¿Cuál es el sustrato preferido para Endo S? R: IgG es el sustrato preferido. Además, los informes de la literatura han demostrado que Endo S no escinde la IgM o IgA del suero humano * * Collin, M., Olsen, A. EndoS, Una nueva proteína secretada por Streptococcus pyogenes con actividad endoglicosidasa sobre la IgG humana. The EMBO Journal (2001) Vol. 20 Núm. 12 págs. 3046-3055. P: ¿Cuáles son las condiciones de reacción típicas para Endo S? R: Las condiciones de reacción típicas son las siguientes: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones enzimáticas deben determinarse empíricamente para un sustrato específico. Combine 100 µg de IgG nativa, 1 µL de GlycoBuffer 1 10X y H₂O (si es necesario) para obtener un volumen total de reacción de 10 µL. Añada 1 µL de Endo S. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Las reacciones pueden aumentarse linealmente para acomodar volúmenes de reacción mayores. P: ¿Cómo elimino Endo S de una reacción? R: Endo S puede eliminarse de una reacción de desglicosilación utilizando las perlas magnéticas de quitina de NEB. Condiciones de reacción típicas para la eliminación 1-5 µL de Remove-iT® Endo S con perlas magnéticas de quitina son los siguientes: Materiales: Endo S (NEB #P0741) Perlas magnéticas de quitina (NEB #E8036) Gradilla de separación magnética (NEB #S1506 o NEB #S1509) Pipetear 50 µl de perlas magnéticas de quitina en un tubo eppendorf y colocar el eppendorf en una gradilla de separación magnética. Dejar que el imán atraiga las perlas de quitina, luego pipetear el sobrenadante líquido y desecharlo. Con el eppendorf en la gradilla de separación magnética, lavar las perlas magnéticas de quitina 2 x 500 µl con 50 mM de formiato de NH4 pH 4,4 (o el tampón de elección). Pipetear el sobrenadante y desecharlo. Añadir la muestra de glicoproteína desglicosilada al eppendorf con perlas magnéticas de quitina. Agitar la muestra de glicoproteína desglicosilada con las perlas magnéticas de quitina durante 10 minutos a 4 °C. Colocar el Coloque el eppendorf de nuevo en la gradilla de separación magnética y deje que el imán atraiga las perlas de quitina. Pipetee el sobrenadante y consérvelo. Lave las perlas magnéticas de quitina 3 x 100 µl con 50 mM de formato de NH4 a pH 4,4 (o el tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante de cada lavado y consérvelo. Combine todos los sobrenadantes de los pasos 5 y 6, ya que estos son la glicoproteína desglicosilada. Analice la muestra con el método de su elección. Nota: La eliminación de Endo S de la reacción de desglicosilación se puede aumentar linealmente con volúmenes mayores de perlas magnéticas de quitina. P: ¿Cuál es la capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina utilizadas para eliminar Endo S? R: La capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina (NEB n.° E8036) es de aproximadamente 0,4 mg/ml de proteína marcada con CBD. Esta capacidad de unión se calcula en mg de proteína por volumen de lecho de resina. Las perlas magnéticas de quitina son una suspensión 50:50. Por lo tanto, 50 µl de La suspensión producirá un volumen de lecho de resina de 25 μl, suficiente para eliminar de 1 a 5 µL de Endo S. P: ¿Es Endo S compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: Endo S se suministra en un tampón de almacenamiento sin glicerol, compatible con espectrometría de masas. Endo S se puede utilizar en condiciones de reacción nativas o DTT (véase la pregunta 3), ambas compatibles con análisis posteriores por HPLC y MS. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glycosidase han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir utilizando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se suministran con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. La actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa se evaluó en ambos Su sistema de tampón antiguo y nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o presentan una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglucosidasas se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglucosidasas se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA potencia la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (p. ej., tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) se suministran cuando se requieren. Enzima Producto n.° Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambiado? α-N-acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 no β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin O-glicosidasa y neuraminidasa Bundle E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGase A p0707 --- GlycoBuffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Desglicosilación Mezcla de tampones 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Tampón Rapid PNGase F ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Tampón Rapid PNGase F (formato no reductor) P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Vienen en dos variedades, endoglicosidasas que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas y exoglicosidasas que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es uno generado por una endoglicosidasa. Los investigadores con frecuencia utilizan una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos utilizando SDS-PAGE o varios tipos de cromatografía líquida.