Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, P0742S, Endo D

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 15 de junio de 2025. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas: Endoglicosidasas, Aplicaciones de análisis de proteomas, Sistemas de expresión, Secuenciación de glicanos, Proteómica, Definición de unidad de especificación : Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para eliminar > 95% del carbohidrato de 10 μg de fetuina recortada con glicosidasa (núcleo de trimanosilo) en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 2 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 2 50 mM Fosfato de sodio (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 140 kDa Unidad Condiciones del ensayo 10 μg de fetuina recortada con glicosidasa (núcleo de trimanosilo) se desnaturalizan con 1X DTT a 95 °C durante 3 minutos. Después de la adición de 1X GlycoBuffer 2, se añaden diluciones dobles de Endo D y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Qué es la etiqueta en Endo D? R: Endo D está marcada con un dominio de unión a quitina (CBD). La etiqueta CBD permite su eliminación de una reacción mediante perlas magnéticas de quitina (NEB n.° E8036). Nota: No existe un punto de corte entre Endo D y la etiqueta CBD que permita su eliminación. P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGasa F, Endo S y Endo D? R: La PNGasa F escinde entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos híbridos, complejos y con alto contenido de manosa de las glicoproteínas N-ligadas. Endo S tiene una alta especificidad para eliminar los glicanos N-ligados del núcleo de quitobiosa de la IgG nativa. Por otro lado, Endo D escinde, dentro del núcleo de quitobiosa, los glicanos N-ligados de paucimanosa de las glicoproteínas y los glicopéptidos, con o sin extensiones en las antenas. P: ¿Cuál es un protocolo de reacción típico para Endo D? R: Recomendamos utilizar 1 µL de Endo D por cada 20 µg de N-glicanos ligados a paucimanosa. Combine 10-20 µg de glicoproteína, 1 µL de 10X DTT y H2O (si es necesario para hacer un volumen de reacción total de 10 µL). Desnaturalice la glicoproteína calentando la reacción a 95 °C durante 3 minutos. Haga un volumen de reacción total de 20 µL agregando 2 µL de 10X GlycoBuffer 2, H2O y 1 µL de Endo D. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. Nota: Para desglicosilar varias glicoproteínas en condiciones nativas, pueden requerirse tiempos de incubación más largos, así como más enzima. Las reacciones pueden escalarse linealmente para acomodar volúmenes de reacción mayores. P: ¿Inhibirá SDS a Endo D? R: Sí, Endo D es inhibida por SDS y, a diferencia de otras endoglicosidasas, NP-40 no contrarresta la inhibición de SDS. Por lo tanto, no se recomienda el uso de Endo D con NEB Tampón desnaturalizante de glicoproteínas que contiene SDS y DTT. El enzymeco se vende en su lugar con una solución de DTT 10X para fines de desnaturalización sin SDS. P: ¿Cómo elimino Endo D de una reacción? R: Endo D se puede eliminar de una reacción de desglicosilación utilizando las perlas magnéticas de quitina de NEB (NEB n.° E8036). Las condiciones de reacción típicas para eliminar de 1 a 5 µL de Remove-iT® Endo D utilizando perlas magnéticas de quitina son las siguientes: Materiales: Endo D (NEB n.° P0742), perlas magnéticas de quitina (NEB n.° E8036), gradilla de separación magnética (NEB n.° S1506, NEB n.° S1509). Pipetee 50 µL de perlas magnéticas de quitina en un tubo Eppendorf y coloque el tubo Eppendorf en una gradilla de separación magnética. Deje que el imán atraiga las perlas de quitina, luego pipetee el sobrenadante líquido y deséchelo. Con el tubo Eppendorf en la gradilla de separación magnética, lave el tubo magnético. Perlas de quitina: 2 x 500 µl con NH4Formiato 50 mM, pH 4,4 (o tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante y deséchelo. Añada la muestra de glicoproteína desglicosilada al eppendorf con perlas magnéticas de quitina. Agite la muestra de glicoproteína desglicosilada con las perlas magnéticas de quitina durante 10 minutos a 4 °C. Vuelva a colocar el eppendorf en la gradilla de separación magnética y deje que el imán atraiga las perlas de quitina. Pipetee el sobrenadante y consérvelo. Lave las perlas magnéticas de quitina: 3 x 100 µl con NH4Formiato 50 mM, pH 4,4 (o tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante de cada lavado y consérvelo. Combine todos los sobrenadantes de los pasos 5 y 6, ya que estos son la glicoproteína desglicosilada. Analice la muestra con el método de su elección. Notas: La eliminación de Endo D de la reacción de desglicosilación se puede aumentar linealmente con perlas magnéticas de quitina más grandes. volúmenes. El volumen de reacción ideal para 50 μl de resina de quitina está en el rango de igual volumen a no más de 5X el volumen del lecho de perlas. P: ¿Cuál es la capacidad de unión de las Perlas Magnéticas de Quitina utilizadas para eliminar Endo D? R: La capacidad de unión de las Perlas Magnéticas de Quitina (NEB# E8036) es de aproximadamente 0,4 mg/ml de proteína marcada con CBD. Esta capacidad de unión se calcula en mg de proteína por volumen de lecho de resina. Las perlas magnéticas de quitina son una suspensión 50:50. Por lo tanto, 50 μl de suspensión producirán 25 μl de volumen de lecho de resina, que es suficiente para eliminar 1-5 µL de Endo D. P: ¿Es Endo D compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: Endo D se suministra en un tampón de almacenamiento sin glicerol, compatible con espectrometría de masas. Endo D se puede utilizar en condiciones de reacción nativas o DTT (ver pregunta 3), que son compatibles con el análisis posterior por HPLC y MS. P: ¿Por qué las enzimas NEB Glicosidasas han cambiado de tampón de reacción? ¿Cuáles son los nuevos tampones de reacción? ¿Puedo seguir usando una enzima con su tampón anterior? ¿Dónde puedo encontrar la composición de los tampones anteriores? R: Para simplificar los flujos de trabajo y las digestiones con dos o más exoglicosidasas, la mayoría de las enzimas ahora se suministran con GlycoBuffer 1 10X. Dos excepciones se suministran con GlycoBuffer 4. Además, se ha simplificado el panel de tampones para endoglicosidasas. Se evaluó la actividad de cada enzima endo y exoglicosidasa tanto en su sistema de tampón anterior como en el nuevo. Todas las enzimas conservan la misma actividad o presentan una mayor actividad en el nuevo tampón. Algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de rHSA (la rHSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Como antes, algunas exoglicosidasas aún se suministran con un vial adicional de BSA (la BSA mejora la actividad de ciertas enzimas). Otros componentes (p. ej., tampón desnaturalizante de glicoproteínas, NP-40, etc.) aún se proporcionan cuando se requieren. Enzima Producto # Tampón antiguo Tampón actual ¿Cambiado? α-N-Acetilgalactosaminidasa P0734 G7 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2 Fucosidasa P0724 G4 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,4,6 Fucosidasa P0748 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,4,6 Fucosidasa O p0749 --- GlycoBuffer 1 --- α1-3,4 Fucosidasa p0769 --- GlycoBuffer 1 --- α1-2,3 Manosidasa P0729 G6 GlycoBuffer 1 no α1-6 Manosidasa P0727 G2 GlycoBuffer 1 SÍ α1-2,3,6 Manosidasa p0768 --- GlycoBuffer 4 --- α1-3,4,6 Galactosidasa P0747 --- GlycoBuffer 1 ---- α1-3,6 Galactosidasa P0731 G6 GlycoBuffer 1 no α2-3 Neuraminidasa S P0743 --- GlycoBuffer 1 --- α2-3,6,8 Neuraminidasa P0720 G1 GlycoBuffer 1 SÍ α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A P0722 --- GlycoBuffer 1 --- β-N-Acetilhexosaminidasef P0721 G2 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa P0732 G1 GlycoBuffer 1 SÍ β-N-Acetilglucosaminidasa S P0744 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3 Galactosidasa P0726 G6 GlycoBuffer 1 sin β1-4 Galactosidasa S P0745 --- GlycoBuffer 1 --- β1-3,4 Galactosidasa p0746 --- GlycoBuffer 4 --- Kit de secuenciación de N-glicanos E0577 --- GlycoBuffer 1 --- Endo S P0741 G6 GlycoBuffer 1 SÍ Endo H P0702 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo Hf P0703 G5 GlycoBuffer 3 SÍ Endo F2 p0772 --- GlycoBuffer 4 --- Endo F3 p0771 --- GlycoBuffer 4 --- Endo D P0742 G7 GlycoBuffer 2 sin O-Glicosidasa P0733 G7 GlycoBuffer 2 sin Paquete de O-Glicosidasa y Neuraminidasa E0540 G7 GlycoBuffer 2 sin Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F P0704 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol) P0705 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F, recombinante P0708 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa F (sin glicerol), recombinante P0709 G7 GlycoBuffer 2 sin PNGasa A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- Protein Deglycosylation Mix II p6044 --- Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2 --- Rapid PNGase F P0710 --- Rapid PNGase F Buffer ---- Rapid™ PNGase F (formato no reductor) p0711 --- Rapid PNGase F (formato no reductor) Buffer P: ¿Puede Endo D escindir glicanos en condiciones nativas? R: Sí, Endo D puede escindir glicanos de algunas glicoproteínas en condiciones nativas si La estructura del glicano se recorta al núcleo trimanosilo. Por ejemplo, se incubaron 10 µg de Rituximab (anticuerpo quimérico IgG1 humano/ratón) con las siguientes glicosidasas: 50 unidades de α2-3,6,8,9-neuraminidasa A (NEB n.° P0722), 8 unidades de β1-4-galactosidasa S (NEB n.° P0745), 8 unidades de β-N-acetilglucosaminidasa S (NEB n.° P0744) y 250 unidades de Endo D (NEB n.° P0742) en tampón glicosilado 1X, incubándose durante la noche a 37 °C. Esto resultó en la eliminación completa del glicano del anticuerpo.