New England Biolabs, P0743S, α2-3 Neuraminidasa S

La α2-3 neuraminidasa S es una exoglucosidasa altamente específica que cataliza la hidrólisis de α2-3 enlazada Categorías relacionadas Exoglucosidasas Aplicaciones Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Digestión de proteínas, Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para escindir > 95% del α-Neu5Ac terminal de 1 nmol Neu5Acα2-3Galβ1- 3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-AMC, en 1 hora a 37°C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular Aparente: 74 kDa Actividad específica 160.000 unidades/mg Unidad Condiciones del ensayo Se incuban diluciones dobles de α2-3 Neuraminidasa S con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 1 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina (1). Preguntas frecuentes P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Cuál es la diferencia entre las cuatro enzimas neuraminidasas que comercializa NEB: α2-3,6,8-neuraminidasa, α2-3,6,8,9-neuraminidasa A, α2-3-neuraminidasa y α2-3-neuraminidasa S? A: La α2-3,6,8-neuraminidasa (NEB# P0720) se clona a partir de Clostridium perfringens y escinde residuos de ácido siálico enlazados a α2-3, α2-6 y α2-8. La α2-3,6,8,9-neuraminidasa A (NEB# P0722) se clona a partir de Arthrobacter ureafaciens y escinde residuos de ácido siálico enlazados a α2-3, α2-6, α2-8 y α2-9. También puede escindir residuos de ácido siálico ramificados que están enlazados a un residuo interno. La α2-3-neuraminidasa (NEB# P0728) se clona a partir de Salmonella typhimurium LT2 y escinde residuos de ácido siálico enlazados a α2-3. La α2-3 neuraminidasa S (NEB# P0743) se clona a partir de Streptococcus pneumoniae y escinde residuos de ácido siálico con enlaces α2-3. P: ¿Puedo usar la α2-3 neuraminidasa S en una digestión doble con otras exoglucosidasas o endoglicosidasas? R: Sí. Recomendamos realizar una digestión doble de la α2-3 neuraminidasa S con otras exoglucosidasas utilizando GlycoBuffer 1 1X (50 mM de acetato de sodio, pH 5,5, 5 mM de CaCl₂). Recomendamos utilizar el tampón de reacción G7 1X (50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5) para la digestión de la α2-3 neuraminidasa S con PNGasa F o O-glucosidasa. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la α2-3 neuraminidasa S? R: Fetuína (NEB# P6042) o ácido pNP-N-acetil-neuramínico. La fetuína contiene residuos de ácido siálico terminales α2-3 y α2-6; la α2-3 Neuraminidasa S solo escinde los residuos con enlaces α2-3; por lo tanto, el cambio de peso molecular (debido a la pérdida de ácido siálico) será intermedio en comparación con el tratamiento con una neuraminidasa general. P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglucosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se alejan de la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad de la enzima. La digestión de algunas proteínas con exoglucosidasa requerirá tiempos de incubación más largos o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glucopéptido tras el tratamiento con exoglucosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Inhiben los detergentes las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F Recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-Glicosidasa, que se inhiben con SDS. P: ¿Las enzimas NEB Neuraminidasa escinden residuos de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc)? R: Dependiendo de la fuente y la especificidad de la enzima, algunas neuraminidasas escinden tanto Neu5Ac como Neu5Gc, mientras que otras escinden solo Neu5Ac. Aquellos que escinden tanto Neu5Ac como Neu5Gc, tienden a tener una menor eficiencia hacia Neu5Gc. NEB# P0720 (a2-3,6,8 Neuraminidasa): escinde tanto Neu5Ac como Neu5Gc NEB# P0722 (a2-3,6,8,9 Neuraminidasa A): escinde tanto Neu5Ac como Neu5Gc NEB# P0743 (a2-3 Neuraminidasa S): escinde solo Neu5Ac P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe usar? R: La cantidad de enzima requerida varía cuando se usan diferentes sustratos. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si todavía hay material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche.