New England Biolabs, P0744S, β-N-acetilglucosaminidasa S

La β-N-acetilglucosaminidasa S es una exoglucosidasa que cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores de β-N-acetilglucosamina de oligosacáridos. Categorías relacionadas Exoglucosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Digestión de proteínas,, Expresión de glucoproteínas recombinantes, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la β- N -acetilglucosamina terminal no reductora de 1 nmol de GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-7-amino-4-metilcumarina (AMC), en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor No Peso molecular aparente: 125 kDa Unidad Condiciones del ensayo Se incuban diluciones dobles de β- N -Acetilglucosaminidasa S con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 1 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina (1). Preguntas frecuentes P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Cuál es la diferencia entre la β-N-acetilglucosaminidasa y la β-N-acetilglucosaminidasa S (NEB# P0744)? R: La β-N-acetilglucosaminidasa se clona a partir de Xanthomonas manihotis; mientras que la β-N-acetilglucosaminidasa S (NEB# P0744) se clona a partir de Streptococcus pneumoniae. Ambas enzimas escinden residuos de N-acetilglucosamina con enlaces β1-2,3,4,6. Las dos versiones de la enzima tienen concentraciones unitarias idénticas. La β-N-acetilglucosaminidasa S (NEB# P0744) es capaz de escindir eficientemente residuos de β-N-acetilglucosamina que se bisecan. P: ¿Puedo usar la β-N-acetilglucosaminidasa S en una mezcla con Endo H/Hf o PNGasa F? R: Sí. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la β-N-acetilglucosaminidasa S? R: pNP-GlcNAc P: ¿Puedo usar la β-N-acetilglucosaminidasa S en una digestión doble con otras exoglucosidasas y/o endoglicosidasas? R: Sí. Recomendamos la doble digestión de la β-N-acetilglucosaminidasa S con otras exoglicosidasas utilizando GlycoBuffer 1 1X (50 mM de acetato de sodio, pH 5,5, 5 mM de CaCl₂). Recomendamos utilizar el tampón de reacción G7 1X (50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5) para la digestión de la β-N-acetilglucosaminidasa S con PNGasa F y/o O-glucosidasa. P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglicosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se alejan de la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad de la enzima. La digestión de algunas proteínas con exoglicosidasas requerirá tiempos de incubación más largos o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glucopéptido tras el tratamiento con exoglucosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Inhiben los detergentes las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-glicosidasa, que se inhiben con SDS. P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía según el sustrato. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún queda material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche.