New England Biolabs, P0745S, β1-4 Galactosidasa S

La β1-4 galactosidasa S es una exoglucosidasa altamente específica que cataliza la hidrólisis de residuos de galactosa terminales no reductores con enlaces β1-4 a partir de oligosacáridos. Categorías relacionadas Exoglucosidasas Aplicaciones Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Digestión de proteínas, Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la β-D-galactosa terminal de 1 nmol Galβ1-4GlcNAcβ1- 3Galβ1-4Glc-7-amino-4-metil-cumarina (AMC), en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular Aparente: 231 kDa Actividad específica 123 000 unidades/mg Unidad Condiciones del ensayo Se incuban diluciones dobles de β1-4 Galactosidasa S con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 1 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía de capa fina (1). Preguntas frecuentes P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Vienen en dos variedades, endoglicosidasas que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas y exoglicosidasas que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es uno generado por una endoglicosidasa. Los investigadores con frecuencia utilizan una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o varios tipos de cromatografía líquida. P: ¿Cuál es la diferencia entre la β1–4 galactosidasa y la β1–4 galactosidasa S? R: La β1–4 galactosidasa (NEB# P0730) se clona de Bacteroides fragilis; mientras que la β1–4 galactosidasa S (NEB# P0745) se clona de Streptococcus pneumoniae. Ambas enzimas escinden residuos de galactosa enlazados a β1–4. Las dos versiones de la enzima tienen idéntica actividad, especificidad y concentración. P: ¿Cuál es la diferencia entre la β1–4 Galactosidasa S y la β1–3 Galactosidasa? R: La β1–4 Galactosidasa S solo escinde residuos de galactosa con un enlace glucosídico enlazado a β1–4, mientras que la β1–3 Galactosidasa escinde residuos de galactosa con enlaces glucosídicos enlazados a β1–3 y, con menor eficiencia, a β1–6. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la β1–4 Galactosidasa S? R: pNP-βGal (4-nitrofenil-β-D-galactopiranósido) P: ¿Puedo usar la β1–4 Galactosidasa S en una digestión doble con otras exoglucosidasas y/o endoglicosidasas? R: Sí. Recomendamos la doble digestión de la β1–4 Galactosidasa S con otras exoglucosidasas utilizando GlycoBuffer 1 1X (50 mM NaAcetato, pH 5,5, 5 mM CaCl₂). Recomendamos utilizar el tampón de reacción G7 1X (50 mM fosfato sódico, pH 7,5) para la digestión de la β1–4 Galactosidasa S con PNGasa F y/o O-Glucosidasa. P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglucosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se alejan de la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad de la enzima. La digestión de algunas proteínas con exoglucosidasas requerirá tiempos de incubación más largos o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glucopéptido tras el tratamiento con exoglucosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Inhiben los detergentes las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-glicosidasa, que se inhiben con SDS. P: ¿Qué enzima se debe utilizar para eliminar los residuos de galactosa con enlaces β1-4 de la IgG intacta? R: Los residuos de galactosa con enlaces β1-4 pueden ser difíciles de eliminar de la IgG intacta en condiciones nativas, y la actividad varía considerablemente según el subtipo de IgG. Normalmente se necesitan incubaciones prolongadas y un aumento de las unidades para observar la renovación del sustrato. La β1-4 galactosidasa S (NEB n.° P0745) es la enzima preferida para este propósito, ya que la β1-4 galactosidasa (NEB n.° P0730) tiene una actividad muy baja en la IgG intacta. Un protocolo que utiliza hasta 50*g de Rituximab (IgG1 derivada de CHO) con 80 unidades (10 μl) de β1-4 Galactosidasa S (NEB #P0745 en 1X GlycoBuffer 1 en un volumen total de 50 μl, incubado durante 24 horas a 37 °C produce una eliminación eficiente de residuos de β1-4 galactosa. Sin embargo, condiciones similares tratando una IgG2a murina produce solo una eliminación de ~70-80% de residuos de β1-4 galactosa. P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía cuando se utilizan diferentes sustratos. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si todavía hay material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche.