New England Biolabs, P0746S, β1-3,4-galactosidasa

La β1-3,4 galactosidasa es una exoglucosidasa que cataliza la hidrólisis de residuos de galactosa terminales no reductores unidos a β1-3 y β1-4 de oligosacáridos. Categorías relacionadas Exoglucosidasas Aplicaciones Secuenciación de glicanos,, Expresión de glucoproteínas recombinantes,, Análisis de glucoproteínas Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la β-D-galactosa terminal de 1 nmol Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-amino-4-metil-cumarina (AMC), en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 4 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 4 50 mM de acetato de sodio (pH 4,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular teórico: 71 kDa Condiciones de ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de β1-3,4 galactosidasa con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 4 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina (1). Preguntas frecuentes : P: ¿Cuál es la diferencia entre la β1-4-galactosidasa, la β1-4-galactosidasa S y la β1-3,4-galactosidasa? R: La β1-4-galactosidasa (NEB# P0730) se clona a partir de Bacteroides fragilis; la β1-4-galactosidasa S (NEB# P0745) se clona a partir de Streptococcus pneumoniae, y la β1-3,4-galactosidasa (NEB# P0746) se clona a partir de testículo bovino. La β1-4-galactosidasa y la β1-4-galactosidasa S solo escinden residuos de galactosa con enlaces β1-4. En cambio, la β1-3,4-galactosidasa (BTG) escinde tanto residuos de galactosa con enlaces β1-3 como β1-4. P: ¿Puede la β1-3,4-galactosidasa escindir residuos de galactosa con enlaces β1-6? R: Aunque son poco comunes en la naturaleza, se ha demostrado que los residuos de galactosa con enlaces β1-6 son hidrolizados por la β1-3,4-galactosidasa a una velocidad mucho menor que los residuos de galactosa con enlaces β1-3 o β1-4. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la β1-3,4-galactosidasa? R: pNP-βGal (4-nitrofenil-β-D-galactopiranósido). P: ¿Puedo usar la β1-3,4-galactosidasa en una digestión doble con otras exoglucosidasas o endoglicosidasas? R: Sí. Aunque el tampón óptimo para la β1-3,4-galactosidasa es el glicotampón 4 1X (acetato de sodio 50 mM, pH 4,5), recomendamos realizar una doble digestión de la β1-3,4-galactosidasa con otras exoglucosidasas utilizando el glicotampón 1 1X (acetato de sodio 50 mM, pH 5,5, CaCl₂ 5 mM). Recomendamos utilizar el glicotampón 2 1X (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5) para la digestión de la β1-3,4-galactosidasa con PNGasa F y/o O-glucosidasa. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glucopéptido tras el tratamiento con exoglucosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Cuánta exoglucosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía según el sustrato. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún queda material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche. P: ¿Qué son las glicosidasas y para qué sirven? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: las endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y las exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es el generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida. P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglicosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se orientan en dirección opuesta a la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad enzimática. La digestión de algunas proteínas con exoglicosidasas requerirá tiempos de incubación más prolongados o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Inhiben los detergentes las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F Recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-Glicosidasa, que son inhibidas por SDS.