New England Biolabs, P0749L, α1-2,4,6 Fucosidasa O

La α1-2,4,6 fucosidasa O es una exoglucosidasa de amplia especificidad que cataliza la hidrólisis de los residuos de fucosa con enlaces terminales α1-2, α1-4 y α1-6 de oligosacáridos. La α1-2,4,6 fucosidasa O escinde los residuos de fucosa α1-6 de forma más eficiente que otros enlaces. Categorías relacionadas Exoglucosidasas,, Aplicaciones de análisis del proteoma Secuenciación de glicanos,, Proteómica,, Expresión de glucoproteínas recombinantes, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la fucosa de 1 nmol de GlcNAc(Fucα1-6)β1-4GlcNAc-AMC en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 20 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 49 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de α1-2,4,6 Fucosidasa O con 1 nmol de sustrato marcado con AMC y 1X GlycoBuffer 1 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía de capa fina (1). Preguntas frecuentes : P: ¿Cuál es la diferencia entre la α1-2,3,4,6 fucosidasa y la α1-2,4,6 fucosidasa O? R: La α1-2,4,6 fucosidasa O, clonada de la bacteria Omnitrophica, es una exoglucosidasa de amplia especificidad que cataliza la hidrólisis de los residuos terminales de fucosa α1-6 con mayor eficiencia que la de los residuos de fucosa unidos a α1-2 y α1-4. Además, la α1-2,4,6 fucosidasa O puede escindir glicanos aminados reductivamente, así como glicanos con marcadores instantáneos. Considerando que la α1-2,3,4,6 fucosidasa (NEB# P0748) se clona a partir de riñón bovino y se expresa en E. coli. Es una enzima de amplia especificidad que cataliza la hidrólisis de residuos de fucosa con enlaces α1-2 y α1-6 con mayor eficiencia que la de los residuos de fucosa con enlaces α1-4 y α1-3. P: ¿Puede la α1-2,4,6 fucosidasa O escindir residuos de fucosa en presencia de glicanos marcados con marcadores instantáneos? R: Sí, la α1-2,4,6 fucosidasa O puede escindir residuos de fucosa de oligosacáridos o glicanos liberados que han sido marcados con marcadores instantáneos como Instant 2AB, Instant Procainamida o RapiFluor. Las muestras marcadas con marcadores instantáneos pueden requerir tiempos de incubación más prolongados (18 horas) para una digestión completa. P: ¿Puedo usar la α1-2,4,6 Fucosidasa O en una digestión doble con otras exoglucosidasas? R: Sí. Recomendamos la digestión simultánea con otras exoglucosidasas utilizando GlycoBuffer 1 1X (50 mM de acetato de sodio, pH 5,5, 5 mM de CaCl₂). Por ejemplo, la α1-2,4,6 Fucosidasa O se puede combinar en una digestión simultánea con otras exoglucosidasas como la α2-3,6,8,9 Neuraminidasa A (NEB# P0722), la α1-3,4,6 Galactosidasa (NEB# P0747), la β1-4 Galactosidasa S (NEB# P0745) y la β-N-Acetilglucosaminidasa S (NEB# P0744). P: ¿Puede la α1-2,4,6 Fucosidasa O escindir residuos de fucosa α1-3? R: No, la α1-2,4,6 Fucosidasa O no escinde residuos de fucosa α1-3. P: ¿Puede la α1-2,4,6 Fucosidasa O escindir sustratos ramificados y complejos? R: La α1-2,4,6 Fucosidasa O escinde residuos de fucosa α1-6 ramificados y presenta una actividad mínima en residuos de fucosa α1-4 ramificados. La enzima no escinde residuos de fucosa α1-2 ramificados. Para la digestión de sustratos de oligosacáridos complejos con múltiples ramificaciones, pueden requerirse tiempos de incubación más prolongados (de 4 horas a toda la noche). P: ¿Puede la α1-2,4,6 Fucosidasa O escindir residuos de fucosa de un anticuerpo intacto? R: La α1-2,4,6 Fucosidasa O solo es activa en un anticuerpo intacto si se recorta al núcleo trimanosilo. P: ¿Cuál es la temperatura óptima de incubación para la α1-2,4,6 Fucosidasa O? R: La temperatura óptima de incubación cuando se utiliza la enzima sola es de 50 °C. La definición de la unidad enzimática se calcula utilizando una temperatura de reacción de 37 °C para permitir la digestión simultánea con glicosidasa y los protocolos de secuenciación de N-glicanos. Una temperatura de reacción de 37 °C resulta en una actividad aproximadamente un 35 % menor. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o un glucopéptido tras el tratamiento con exoglicosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado).