New England Biolabs, P0761S, O-glicoproteasa (IMPa)

La O-glicoproteasa (IMPa) es una proteasa de amplia especificidad que escinde los enlaces peptídicos de una glicoproteína o un glicopéptido inmediatamente N-terminal a un residuo de serina o treonina que contiene un glicano O-enlazado de tipo mucina con o sin sialilación. Categorías relacionadas Herramientas de proteínas, Proteasas, Glicobiología, Aplicaciones Glicómica y glicoproteómica, Digestión de proteínas, Glicobiología y proteómica, Definición de unidad de especificación Una unidad de O-glicoproteasa (IMPa) escindirá > 90% de 2 pmol de O-glicopéptido marcado con FAM en un volumen total de reacción de 20 μl en 2 horas a 37 °C en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 100 mM pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 95 °C durante 10 minutos Peso molecular teórico: Unidad de 97 kDa Condiciones de ensayo Se incuban diluciones dobles de O-glicoproteasa (IMPa) con 2 μM de O-glicopéptido marcado con FAM y Tris-HCl 20 mM pH 8,0 en una reacción de 20 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 2 horas. La separación de los productos de reacción se determina mediante análisis CE. Preguntas frecuentes P: ¿Se puede escalar linealmente una reacción de O-glicoproteasa (IMPa) para acomodar la digestión de más de 10 μg de glicoproteína? R: Sí, la reacción de O-glicoproteasa (IMPa) se puede escalar linealmente. Las condiciones típicas de reacción recomiendan 1 µl de O-glicoproteasa (IMPa) por cada 10 µg de sustrato; las reacciones se pueden escalar linealmente manteniendo una relación enzima:sustrato de 1:10. Sin embargo, la relación enzima-sustrato exacta debe determinarse empíricamente, ya que la pureza del sustrato, el plegamiento estricto, el grado de glicosilación y la agrupación de los sitios de O-glicosilación (IMPa) pueden afectar la eficiencia de la digestión. En algunos casos, pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos (18 horas) y más enzima. Se recomienda primero probar la eficiencia de la digestión a pequeña escala (10 µg) antes de aumentar la escala y monitorear la eficiencia de la escisión mediante análisis SDS-PAGE. P: ¿Es activa la O-glicoproteasa (IMPa) en presencia de agentes reductores o detergentes? R: No, la O-glicoproteasa (IMPa) no es activa en presencia de agentes reductores o detergentes. La adición de 1 mM de DTT o detergentes como Invitrosol (Thermo, n.° MS1007) y Protease Max (Promega, n.° V2071) inactiva completamente la enzima. Si se utilizan agentes reductores o detergentes, la glicoproteína debe purificarse antes de añadir la O-glicoproteasa (IMPa). Recomendamos la columna de eliminación de detergente HiPPR Detergent Removal Resin (catálogo Thermo n.° 88306), que debe utilizarse según las instrucciones del fabricante. P: ¿Es la O-glicoproteasa (IMPa) activa en tampones distintos a Tris-HCl 20 mM, pH 8,0? R: Sí, el rango de pH óptimo para la O-glicoproteasa (IMPa) es de 7,0 a 8,0. La actividad enzimática disminuye significativamente a valores de pH inferiores a 7,0 y superiores a 8,0. La O-glicoproteasa es 100 % activa en HEPES 20 mM, pH 8,0. La enzima tiene una reducción del 50% de actividad en 15-25 mM NH4CO3 y no es activa en 50 mM NH4CO3. P: ¿Es la O-glicoproteasa (IMPa) capaz de escindir eficientemente los sitios O-glicosilados agrupados? R: El análisis de sitios O-glicosilados altamente agrupados puede ser difícil debido a la diversa ocupación del sitio (macroheterogeneidad) y la proximidad de los sitios de O-glicosilación en las glicoproteínas. El análisis paralelo de una glicoproteína nativa y desnaturalizada digerida con O-glicoproteasa (IMPa) puede ayudar a obtener información más completa. En algunos casos, pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos (18 horas) y más enzima. Además, la O-glicoproteasa (IMPa) no escinde entre dos aminoácidos O-glicosilados adyacentes. P: Observo una escisión mínima de mi glicoproteína después del tratamiento con O-glicoproteasa (IMPa). ¿Cómo puedo optimizar la reacción? R: Las glicoproteínas fuertemente plegadas o con sitios O-glicosilados agrupados pueden ser resistentes a la escisión con proteasas. En estos casos, puede ser necesario desnaturalizar el sustrato antes de la digestión con O-glicoproteasa (IMPa) para una digestión óptima. Además, pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos (18 horas) y una mayor cantidad de enzima. Sin embargo, tenga en cuenta que los detergentes y reactivos adicionales deben eliminarse de la reacción antes de añadir O-glicoproteasa (IMPa). P: ¿Es necesario eliminar primero los ácidos siálicos del sustrato antes de la digestión con O-glicoproteasa (IMPa)? R: No, la O-glicoproteasa (IMPa) es completamente activa en glicoproteínas y glicopéptidos sialilados. P: ¿La O-glicoproteasa (IMPa) es activa en los antígenos TF y Tn? R: La O-glicoproteasa (IMPa) escinde eficazmente péptidos que contienen glicanos asialilados más pequeños, como el antígeno TF (Galβ1,3GalNAc-α-) y el antígeno Tn (GalNAc-α-). P: ¿Requiere la O-glicoproteasa (IMPa) iones metálicos para su actividad? R: La O-glicoproteasa (IMPa) es una metaloproteasa. El tratamiento con agentes quelantes como el EDTA la inactiva. La adición de Mn₂, Zn₂ y Cu₂ disminuye la actividad enzimática.