New England Biolabs, P0768S, α1-2,3,6 manosidasa

Categorías relacionadas Exoglucosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Secuenciación de glicanos,, Expresión de glicoproteínas recombinantes,, Análisis de glicoproteínas Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la manosa terminal de 1 nmol de Man(α1,3)-Man(β1,4)-GlcNAc-7-amino-4-metil-cumarina (AMC), en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 4 Suplemento con 1X Zinc Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 4 50 mM acetato de sodio (pH 4,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 95 °C durante 10 minutos Peso molecular Teórico: Unidad de 110 kDa Condiciones del ensayo Se incuban diluciones dobles de α1-2,3,6 manosidasa con 1 nmol de sustrato marcado con AMC, 1X GlycoBuffer 4 y 1X Zinc en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía de capa fina (1). Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre la α1-2,3 manosidasa, la α1-6 manosidasa y la α1-2,3,6 manosidasa? R: La α1-2,3 manosidasa (NEB n.° P0729) y la α1-6 manosidasa (NEB n.° P0727) se clonan a partir de Xanthomonas manihotis, mientras que la α1-2,3,6 manosidasa (NEB n.° P0768) se clona a partir de Canavalia ensiformis (alubia canavalia). La α1-2,3 manosidasa solo escinde residuos de manosa ligados a α1-2 y α1-3, mientras que la α1-6 manosidasa solo escinde residuos de manosa ligados a α1-6. Mientras que la α1-2,3,6 manosidasa (JBM) escinde los tres residuos de manosa α1-2, α1-3 y α1-6. P: ¿Puede la α1-2,3,6 manosidasa (JBM) ser un sustrato para la actividad manosidasa? R: No. La α1-2,3,6 manosidasa es una proteína glicosilada con alto contenido de manosa. La mayor parte de la glicosilación se elimina durante la purificación; sin embargo, aún queda una pequeña cantidad de manosidación. Los glicanos manosilados restantes parecen resistentes a la autodigestión. P: ¿Cuál es un buen control positivo para la α1-2,3 manosidasa? R: pNP-α-manopiranósido (4-Nitrofenil α-D-manopiranósido). P: Al digerir sustratos complejos que incluyen el residuo de manosa α1-6, ¿se pueden usar enzimas manosa adicionales en combinación con la α1-2,3,6 manosidasa? R: Debido a que la α1-2,3,6 manosidasa tiene una actividad ligeramente reducida hacia los residuos de manosa α1-6 (en comparación con los residuos de manosa α1-2 y α1-3), puede ser ventajoso usar la enzima en combinación con la α1-6 manosidasa (NEB #P0727). Se recomienda una digestión secuencial, en la que la digestión con α1-2,3,6 manosidasa es seguida por el tratamiento con α1-6 manosidasa (NEB #P0727). P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglicosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se alejan de la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad de la enzima. La digestión con exoglicosidasa de algunas proteínas requerirá tiempos de incubación más largos o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glicopéptido después del tratamiento con exoglicosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo, cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Cuánta exoglicosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía según el sustrato. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún queda material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche. P: ¿Los detergentes inhiben las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F Recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-Glicosidasa, que son inhibidas por SDS. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Vienen en dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es uno generado por una endoglicosidasa. Los investigadores con frecuencia utilizan una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o varios tipos de cromatografía líquida.