New England Biolabs, P0769S, α1-3,4 Fucosidasa

Categorías relacionadas Exoglucosidasas,, Aplicaciones de análisis de proteomas Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Proteómica, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de la α-fucosa de 1 nmol de Galβ1-4GlcNAcβ1-3(Fucα1-3)Galβ1- 4Glc-7-amino-4-metil-cumarina (AMC), en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 1 Suplementar con 100 µg/ml de albúmina recombinante (bajo contenido de glicerol) Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 1 5 mM CaCl2 50 mM acetato de sodio (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 56 kDa Condiciones de ensayo unitario Diluciones dobles de a1-3,4 Fucosidasa se incuban con 1 nmol de sustrato marcado con AMC en 1X GlycoBuffer 1 suplementado con 1X rHSA en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante cromatografía en capa fina (1). Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre α1-2 Fucosidasa, α1-3,4,6 Fucosidasa y α1-3,4 Fucosidasa? A: La α1-2 fucosidasa (NEB# P0724) se clona de Xanthomonas manihotis y es específica para la escisión de residuos de fucosa α1-2 lineales. La α1-2,4,6 fucosidasa (NEB# P0748) se clona de riñón bovino y se expresa en E. coli y es una enzima de amplia especificidad que cataliza la hidrólisis de residuos de fucosa enlazados α1-2, α1-4 y α1-6. La α1-3,4 fucosidasa (NEB# P0769) se clona del almendro dulce (Prunus dulcis) y se expresa en Pichia pastoris. La α1-3,4 fucosidasa es una enzima de amplia especificidad que cataliza la hidrólisis de residuos de fucosa enlazados α1-3 y α1-4 de oligosacáridos y glicoproteínas. P: ¿Puedo usar la α1-3,4-fucosidasa en una digestión doble con otras exoglucosidasas o endoglicosidasas? R: Sí. Recomendamos realizar una digestión doble de la α1-3,4-fucosidasa con otras exoglucosidasas utilizando GlycoBuffer 1 1X (50 mM de acetato de sodio, pH 5,5, 5 mM de CaCl₂). Para lograr una actividad fucosidasa óptima, complemente la reacción con rHSA. Recomendamos utilizar GlycoBuffer 2 1X (50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5) para la digestión de la α1-3,4-fucosidasa con PNGasa F o O-glucosidasa. P: ¿Puede la α1-3,4-fucosidasa escindir los residuos centrales de fucosa α1-3? R: No, la α1-3,4-fucosidasa no puede eliminar el residuo central de fucosa α1-3. Sin embargo, puede escindir los residuos de fucosa α1-3 ubicados en el brazo externo de los glicanos N-ligados. P: ¿Pueden la α1-3,4 fucosidasa y la α1-2,3,4,6 fucosidasa escindir sustratos ramificados y complejos? R: La α1-3,4 fucosidasa y la α1-2,3,4,6 fucosidasa pueden escindir sustratos ramificados simples hasta completarlos en 1 hora. Sin embargo, puede ser necesaria una mayor concentración de enzima y un tiempo de incubación más prolongado (de 4 horas a toda la noche) para la digestión completa de sustratos complejos con múltiples ramificaciones. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Vienen en dos variedades, las endoglicosidasas que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas y las exoglicosidasas que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores frecuentemente usan una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o varios tipos de cromatografía líquida. P: ¿Los detergentes inhiben las glicosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones incluyen PNGasa F, PNGasa F Recombinante, Remove-iT PNGasa F y O-Glicosidasa, que son inhibidas por SDS. P: ¿Cuál es un buen método para repurificar un glicano o glucopéptido después del tratamiento con exoglicosidasa? R: Filtración con filtros de microcentrifugación o extracción en fase sólida (por ejemplo: cartuchos de carbón grafitizado). P: ¿Esta enzima requiere condiciones desnaturalizantes para actuar sobre las glicoproteínas? R: No, en general, las exoglicosidasas pueden eliminar residuos de azúcar de las glicoproteínas nativas (plegadas) (los glicanos hidrófilos se alejan de la estructura proteica). Sin embargo, el plegamiento de la proteína alrededor de un sitio de glicano podría afectar la accesibilidad de la enzima. La digestión de algunas proteínas con exoglicosidasa requerirá tiempos de incubación más largos o, en algunos casos, una desnaturalización leve. P: ¿Cuánta exoglicosidasa se debe utilizar? R: La cantidad de enzima necesaria varía según el sustrato. Comience con 1-2 µl para 1 µg de glicoproteína o 100 nM de oligosacárido durante una hora en una reacción de 10-25 µl. Si aún queda material sin digerir, deje que la reacción continúe durante la noche.