New England Biolabs, P0770S, p0770-idez-proteasa-igg-específico

La proteasa IdeZ (específica para IgG) es una proteasa recombinante específica para anticuerpos que reconoce subclases de IgG humanas, ovinas, de mono, de conejo y algunas murinas. Escinde específicamente en un único sitio de reconocimiento debajo de la región bisagra para producir un conjunto homogéneo de fragmentos F(ab')2 y Fc. La proteasa IdeZ escinde la IgG2a murina con mayor eficacia que la IdeS. Categorías relacionadas : Proteasas, Aplicaciones del análisis del proteoma, Análisis de anticuerpos y bioterapéuticos, Proteómica. Definición de la unidad de especificación : Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% de 1 µg de IgG humana en 15 minutos a 37 °C, en un volumen total de reacción de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 2 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 2 Fosfato sódico 50 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 50 mM EDTA 1 mM pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular teórico: 35578 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de IdeZ Protease (específica para IgG) con 1 μg de IgG humana y 1X GlycoBuffer 2 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba durante 15 minutos a 37 °C. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Notas de almacenamiento Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la ventaja de IdeZ sobre IdeS? R: IdeZ e IdeS tienen la misma especificidad; ambos se escinden en el mismo sitio único, debajo de la región bisagra de la IgG. Sin embargo, IdeZ es más versátil, ya que escinde la IgG2a de ratón con mayor eficiencia que IdeS. P: ¿Es activa la proteasa IdeZ en solución salina tamponada con fosfato (PBS)? R: Sí, la proteasa IdeZ es activa en PBS. La proteasa IdeZ también funciona en una gama de tampones de pH 6,0 a 9,0. Se observa una disminución significativa de la actividad a pH 5,5 e inferior. El tampón recomendado es Glycobuffer 2 1X (fosfato sódico 50 mM, pH 7,5). P: ¿Se pueden utilizar las microesferas magnéticas de proteína A (NEB# S1425S) para crear grupos de fragmentos Fc y Fab tras la escisión con la proteasa IdeZ? R: Sí, las microesferas magnéticas de proteína A (NEB# S1425S) se pueden usar para crear grupos de fragmentos Fc y Fab tras la escisión con la proteasa IdeZ. El fragmento Fc se unirá a las microesferas y el fragmento Fab permanecerá en el sobrenadante. P: ¿Puede la proteasa IdeZ escindir otras IgG además de la humana? R: La proteasa IdeZ es activa sobre la IgG humana. También se puede usar para preparar fragmentos de IgG2a e IgG3 de ratón con un tiempo de incubación prolongado. La proteasa IdeZ también escinde muchas proteínas de fusión Fc, así como conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). La proteasa IdeZ es activa sobre algunas IgG de mono, conejo y oveja. No escinde IgG de cabra, bovino, porcino ni de rata. Tampoco escinde IgG1 ni IgG2b de ratón. P: ¿Puede la proteasa IdeZ escindir isotipos de Ig distintos de IgG? R: No, la proteasa IdeZ solo es activa sobre IgG. No lo es sobre IgA, IgD, IgE ni IgM. P: ¿Es posible usar la PNGasa F junto con la proteasa IdeZ en condiciones nativas para desglicosilar la porción Fc de un anticuerpo? R: Sí, la PNGasa F y la proteasa IdeZ pueden usarse juntas en un solo paso para fragmentar la IgG y eliminar los glicanos Fc. Las condiciones de reacción típicas se pueden encontrar en la digestión simultánea de IgG con el protocolo de la proteasa IdeZ y la PNGasa F. P: ¿Cuál es el sitio de escisión de la proteasa IdeZ (específica para IgG)? R: IgG1, IgG3, IgG4 humanas: CPAPELLG / GPSVF. IgG2 humana: CPAPPVA / GPSVF. IgG2a murina: CPAPELLG / GPSVF.