Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, P0771S, Endo F3

Endo F3 es una endoglicosidasa que escinde, dentro del núcleo de la quitobiosa, oligosacáridos fucosilados biantenarios y triantenarios de las glicoproteínas. Endo F3 está marcada con un dominio de unión a quitina (CBD) para facilitar su eliminación. Categorías relacionadas: Endoglicosidasas, Aplicaciones del análisis del proteoma, Sistemas de expresión, Secuenciación de glicanos, Proteómica, Definición de la unidad de especificación : Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% del carbohidrato de 10 µg de fibrinógeno porcino en 1 hora a 37 °C en un volumen total de reacción de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 4 Incubar a 37 °C GlycoBuffer 4 50 mM de acetato de sodio (pH 4,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 38,8 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de Endo F3 con 10 µg de fibrinógeno porcino y 1X GlycoBuffer 4 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Endo F3 está marcado? R: Endo F3 está marcado con un dominio de unión a quitina (CBD). La etiqueta CBD permite la eliminación de una reacción utilizando perlas de quitina (NEB #S6651) o perlas magnéticas de quitina (NEB #E8036). Nota: no hay un sitio de escisión entre Endo F3 y la etiqueta CBD que permita la eliminación de esta etiqueta de Endo F3. P: ¿Cuál es la diferencia entre PNGase F y Endo F3? R: PNGase F escinde entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos híbridos, complejos y con alto contenido de manosa de glicoproteínas ligadas a N. Mientras que Endo F3 tiene una alta especificidad para eliminar glicanos ligados a N dentro del núcleo de quitobiosa de glicoproteínas que contienen oligosacáridos fucosilados-biantenarios y triantenarios. P: ¿Cuánto Endo F3 debo usar para desglicosilar una glicoproteína en condiciones nativas? R: Endo F3 siempre debe usarse en condiciones nativas. Recomendamos usar 1 µl de Endo F3 por cada 20 µg de glicoproteína nativa. Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones enzimáticas deben determinarse empíricamente para un sustrato en particular. Las condiciones típicas de reacción son las siguientes: Combine 20 µg de glicoproteína, 1 µL de 10X Glycobuffer 4 y H20 (si es necesario) para hacer un volumen de reacción total de 10 µL. Agregue 1 µL de Endo F3 Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. P: ¿Cuál es el sustrato preferido para Endo F3? R: El fibrinógeno porcino es una glicoproteína que contiene glicanos N-ligados biantenarios fucosilados y se puede usar como control positivo para Endo F3. P: ¿Inhiben los detergentes la actividad de Endo F3? R: Endo F3 solo debe usarse en condiciones no desnaturalizantes (nativas). Los detergentes, como SDS, inhiben la actividad de Endo F3. P: ¿Cuál es el pH óptimo para la actividad de Endo F3? R: El pH óptimo para la escisión de glicanos fucosilados-biantenarios (es decir, fibrinógeno porcino) y triantenarios (es decir, fetuina) por Endo F3 es pH 4,5 (glucotampón 4 10X). Sin embargo, los glicanos fucosilados-biantenarios también pueden ser escindidos por Endo F3 a pH 6,0 (glucotampón 3 10X). P: ¿Cómo elimino Endo F3 de una reacción? R: Endo F3 puede eliminarse de una reacción de desglicosilación utilizando las microesferas magnéticas de quitina de NEB. Las condiciones típicas de reacción con perlas magnéticas de quitina son las siguientes: Materiales: Endo F3 (NEB n.º P0771), perlas magnéticas de quitina (NEB n.º E8036), gradilla de separación magnética (NEB n.º S1506, NEB n.º S1509). Pipetee 50 µl de perlas magnéticas de quitina (NEB n.º E8036) en un tubo eppendorf y coloque el eppendorf en una gradilla de separación magnética (NEB n.º S1506 o S1509S). Deje que el imán atraiga las perlas de quitina, luego pipetee el sobrenadante líquido y deséchelo. Con el eppendorf en la gradilla de separación magnética, lave las perlas magnéticas de quitina 3 x 500 µL con 50 mM de NH4Formiato pH 4,4 (o tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante y deséchelo. Añada la muestra de glicoproteína desglicosilada al eppendorf con perlas magnéticas de quitina. Agite la muestra de glicoproteína desglicosilada con la quitina magnética. perlas durante 10 minutos a 4 °C. Vuelva a colocar el eppendorf en la gradilla de separación magnética y deje que el imán atraiga las perlas de quitina. Pipetee el sobrenadante y consérvelo. Lave las perlas magnéticas de quitina 3 x 100 µL con 50 mM de NH4Formiato pH 4,4 (o el tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante de cada lavado y consérvelo. Combine todos los sobrenadantes de los pasos 5 y 6, ya que estos son la glicoproteína desglicosilada. Analice la muestra con el método de elección. Nota: La eliminación de Endo F3 de la reacción de desglicosilación se puede aumentar linealmente con volúmenes mayores de perlas magnéticas de quitina. P: ¿Cuál es la capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina utilizadas para eliminar Endo F3? R: La capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina (NEB n.º E8036) es de 0,4 µg/µl de proteína marcada con CBD. P: ¿Es Endo F3 compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: Endo F3 y 10X Glycobuffer 4 son compatibles con espectrometría de masas y HPLC. P: ¿Qué son las glicosidasas y cuáles son sus usos? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y luego analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida.