Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, P0772S, Endo F2

Categorías relacionadas Endoglicosidasas Aplicaciones Secuenciación de glicanos Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir > 95% del carbohidrato de 10 µg de fibrinógeno porcino en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl. Condiciones de reacción 1X GlycoBuffer 4 Incubar a 37 °C 1X GlycoBuffer 4 50 mM de acetato de sodio (pH 4,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular aparente: 39,8 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de Endo F2 con 10 µg de fibrinógeno porcino y 1X GlycoBuffer 4 en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La separación de los productos de reacción se visualiza mediante SDS-PAGE. Preguntas frecuentes P: ¿Endo F2 está marcado? R: Endo F2 está marcado con un dominio de unión a quitina (CBD). La etiqueta CBD permite la eliminación de una reacción mediante microesferas de quitina (NEB #S6651) o microesferas magnéticas de quitina (NEB #E8036). Nota: No existe un punto de corte entre la Endo F2 y la etiqueta CBD que permita la eliminación de esta etiqueta de la Endo F2. P: ¿Cuál es la diferencia entre la PNGasa F y la Endo F2? R: La PNGasa F escinde entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos con alto contenido de manosa, híbridos y complejos de las glicoproteínas N-ligadas. Por otro lado, la Endo F2 tiene una alta especificidad para eliminar los glicanos N-ligados dentro del núcleo de la quitobiosa de las glicoproteínas que contienen solo oligosacáridos biantenarios y (a una tasa reducida) con alto contenido de manosa. P: ¿Cuál es la diferencia entre la Endo F2 y la Endo F3? R: Endo F2 elimina los glicanos N-ligados dentro del núcleo de la quitobiosa de las glicoproteínas que contienen solo oligosacáridos biantenarios y (a una tasa reducida) con alto contenido de manosa. Mientras que Endo F3 tiene una alta especificidad para eliminar los glicanos N-ligados dentro del núcleo de la quitobiosa de las glicoproteínas que contienen oligosacáridos fucosilados biantenarios y triantenarios. P: ¿Cuánto Endo F2 debo usar para desglicosilar una glicoproteína en condiciones nativas? R: Recomendamos usar 1 µl de Endo F2 por cada 20 µg de glicoproteína nativa. Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones enzimáticas deben determinarse empíricamente para un sustrato en particular. Las condiciones típicas de reacción son las siguientes: Combine 20 µg de glicoproteína, 1 µL de Glycobuffer 4 10X y H₂O (si es necesario) para completar un volumen total de reacción de 10 µL. Añadir 1 µL de Endo F2. Incube la reacción a 37 °C durante 1 hora. P: ¿Cuál es el sustrato preferido para Endo F2? R: El fibrinógeno porcino es una glicoproteína que contiene glicanos N-ligados biantenarios fucosilados y se puede utilizar como control positivo para Endo F2. P: ¿Inhiben los detergentes la actividad de Endo F2? R: Endo F2 se utiliza normalmente en condiciones no desnaturalizantes (nativas), ya que la desnaturalización no es necesaria para una actividad óptima de la enzima. Sin embargo, Endo F2 es activo en condiciones desnaturalizantes. Las concentraciones de 0,5 % de SDS no inhiben la actividad de Endo F2 cuando se utilizan en presencia de 1 % de NP-40. P: ¿Cuál es el pH óptimo para la actividad de Endo F2? R: El pH óptimo para la escisión de glicanos biantenarios por Endo F2 es pH 4,5 (10X Glycobuffer 4). P: ¿Cómo elimino Endo F2 de una reacción? R: Endo F2 se puede eliminar de una reacción de desglicosilación utilizando las perlas magnéticas de quitina de NEB. Las condiciones típicas de reacción utilizando perlas magnéticas de quitina son las siguientes: Materiales: Endo F2 (NEB# P0772) Perlas magnéticas de quitina (NEB# E8036) Gradilla de separación magnética (NEB# S1506, NEB# S1509) Pipetee 50 µl de perlas magnéticas de quitina (NEB# E8036) en un tubo Eppendorf y coloque el Eppendorf en una gradilla de separación magnética (NEB# S1506, NEB# S1509). Deje que el imán atraiga las perlas de quitina, luego pipetee el sobrenadante líquido y deséchelo. Con el Eppendorf en la gradilla de separación magnética, lave las perlas magnéticas de quitina 3 x 500 µL con 50 mM de NH4Formiato pH 4,4 (o el tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante y deséchelo. Añada la muestra de glicoproteína desglicosilada al eppendorf con perlas magnéticas de quitina. Agite la muestra de glicoproteína desglicosilada con las perlas magnéticas de quitina durante 10 minutos a 4 °C. Vuelva a colocar el eppendorf en la gradilla de separación magnética y deje que el imán atraiga las perlas de quitina. Pipetee el sobrenadante y consérvelo. Lave las perlas magnéticas de quitina 3 x 100 µL con 50 mM de NH4Formiato pH 4,4 (o el tampón de su elección). Pipetee el sobrenadante de cada lavado y consérvelo. Combine todos los sobrenadantes de los pasos 5 y 6, ya que estos son la glicoproteína desglicosilada. Analice la muestra mediante el método de su elección. Nota: la eliminación de Endo F2 de la reacción de desglicosilación se puede aumentar linealmente con volúmenes mayores de perlas magnéticas de quitina. P: ¿Cuál es la capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina utilizadas para eliminar Endo F2? R: La capacidad de unión de las perlas magnéticas de quitina (NEB# E8036) es de 0,4 µg/µl de proteína marcada con CBD. P: ¿Es Endo F2 compatible con análisis posteriores como HPLC y espectrometría de masas? R: Tanto Endo F2 como 10X Glycobuffer 4 son compatibles con espectrometría de masas y HPLC. P: ¿Qué son las glicosidasas y para qué se utilizan? R: Las glicosidasas se utilizan para obtener información sobre los grupos de carbohidratos unidos a las glicoproteínas y los glicopéptidos. Existen dos variedades: endoglicosidasas, que escinden grupos de carbohidratos completos de las proteínas, y exoglicosidasas, que eliminan los monosacáridos de los extremos no reducidos del carbohidrato. Un extremo reducido es aquel generado por una endoglicosidasa. Los investigadores suelen utilizar una endoglicosidasa seguida de una o más exoglicosidasas y, a continuación, analizan los productos mediante SDS-PAGE o diversos tipos de cromatografía líquida.