New England Biolabs, P0773S, Endoglicoceramidasa I (EGCasa I)

Categorías relacionadas Endoglicosidasas Especificación Unidad Definición Una unidad de EGCasa I de R. triatomea se definió como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 μmol de gangliósido GM1a por minuto a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción 1X EGCase I Incubar a 37 °C Tampón de reacción 1X EGCase I Acetato de sodio 50 mM Triton® X-100 al 0,1 % (pH 5,2 a 25 °C) Tampón de almacenamiento NaCl 50 mM Tris-HCl 20 mM EDTA 1 mM pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Peso molecular aparente: 50 kDa Condiciones del ensayo unitario Se incuban diluciones dobles de EGCase I con 10 nmoles de sustrato GM1a en tampón de reacción 1X EGCase I en una reacción de 10 μl. La mezcla de reacción se incuba durante 5 minutos a 37 °C. Los glicanos liberados se marcan con 2-AB y los productos de reacción se analizan mediante cromatografía líquida de interacción hidrófila de ultrarendimiento con detección de fluorescencia. Preguntas frecuentes P: ¿Se puede almacenar la enzima a otras temperaturas? R: La enzima EGCasa I se puede almacenar a 4 °C hasta por 1 mes; a -20 °C por períodos más largos. P: ¿Cómo optimizo la reacción? R: Los tiempos de incubación óptimos y las concentraciones de enzima deben determinarse empíricamente para un sustrato en particular. Las condiciones típicas de reacción son las siguientes: incubar 2 nmol de glicoesfingolípido con 6 mU (1 μL) de EGCasa I durante 16 horas a 37 °C en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,2 que contenga 0,1 % de Triton X-100. El volumen total de reacción es de 20 μL. Los sustratos más complejos pueden requerir EGCasa I adicional para obtener resultados óptimos. P: ¿Qué sustratos adicionales son hidrolizados por EGCasa I? R: Consulte los sustratos enumerados en la Tabla 1 a continuación, que fue adaptada de: Albrecht, S. et al. (2016) Química analítica 88, 4795-4802. Tabla 1. Especificidad del sustrato de la endoglicoceramidasa I recombinante. La siguiente tabla enumera las cantidades de glicanos liberados de los estándares de glucolípidos (2 nmol) utilizando 2 mU de rEGCasa I de R. triatomea después de la incubación a 37 °C durante 16 horas. Sustrato Glicolípido Estructura Hidrólisis % Gangliósidos GM3 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 GM1a Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3) Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 FGM1 Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 GD3 Neu5Acα2-8Neu5Acα2-3Galβ1-4 Glcβ1-1'Cer 100 GD1a Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 GD1b Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-8 Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 GT1b Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Neu5Acα2-8Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 Globosidos Gb4 GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 Cerebrósidos GlcCer Glcβ1-1'Cer 100 GalCer Galβ1-1'Cer 5-10 Sulfátido HSO3-3Galβ1-1'Cer 0 Psicosina Galβ1-1'esfingosina 0 LacCer Galβ1-4Glcβ1-1'Cer 100 P: ¿Puedo comprar grandes cantidades de una enzima existente para la innovación? R: Sí, si necesita grandes cantidades de una enzima para la innovación, póngase en contacto con NEB en EnzymesForInnovation@neb.com. Tenga en cuenta que la disponibilidad puede ser limitada y, por lo tanto, se requieren plazos de entrega más largos para pedidos grandes. También pueden ser necesarias pruebas de control de calidad adicionales para satisfacer su aplicación y necesidades específicas. P: ¿Qué son las enzimas para la innovación? R: Enzimas para la innovación (EFI) es un proyecto iniciado por NEB para proporcionar enzimas únicas a la comunidad científica con la esperanza de permitir el descubrimiento de aplicaciones nuevas e innovadoras. Estas enzimas tienen propiedades interesantes y especificidades únicas que no están disponibles comercialmente en ningún otro lugar con la calidad que esperaría de NEB. Los graduados de Enzimas para la Innovación son enzimas que han pasado de tener aplicaciones desconocidas o exploratorias a convertirse en la piedra angular de una aplicación definida. Si tiene una idea para una "Enzima para la Innovación" con una aplicación sugerida que pueda ser útil, envíenos un correo electrónico a EnzymesForInnovation@neb.com. Para más información, vea el video.