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Categorías relacionadas Glicobiología,, Análisis del proteoma Aplicaciones Glicobiología y proteómica,, Análisis de glicoproteínas Especificación Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 50 mM TCEP 0,2 mM pH 8 Inactivación por calor No Peso molecular Teórico: Unidad de 45 kDa Condiciones de ensayo Prueba funcional (enriquecimiento de N - glicano): una reacción de 200 μL en Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, TCEP 0,2 mM, acetonitrilo al 10%, pH 8,0 que contiene 1 nmol de sialilglicopéptido marcado con fluorescencia y 100 μg de proteína de unión a N - glucopéptido incubada durante 30 minutos a 4 °C da como resultado un enriquecimiento ≥40% determinado por espectroscopia UV-Vis a 520 nm. Preguntas frecuentes : P: ¿Cómo mejora la proteína de unión a N-glicopéptidos el análisis glicoproteómico? R: Los N-glicopéptidos suelen constituir solo una pequeña fracción del total de péptidos proteolizados de una muestra de proteoma complejo; por lo tanto, en un experimento de LC-MS, los N-glicopéptidos suelen verse superados por los no glicopéptidos más abundantes. Además, los iones con mayor eficiencia de ionización, que suelen ser no glicopéptidos, se seleccionan para la fragmentación MS/MS con el fin de obtener información sobre la composición de los glicanos y permitir el descubrimiento de glicopéptidos. Esto puede provocar una subrepresentación significativa de los glicopéptidos en una serie de LC-MS. El enriquecimiento con proteína de unión a N-glicopéptidos reduce significativamente el número total de especies no glicopeptídicas en una muestra. Se dedicará más tiempo del ciclo MS/MS a los N-glicopéptidos enriquecidos, lo que mejora drásticamente la coincidencia de los espectros de N-glicopéptidos y la identificación y el descubrimiento de glicoproteínas. P: ¿Cuál es la especificidad de la proteína de unión a N-glicopéptidos? R: La proteína de unión a N-glicopéptidos ha sido diseñada para unirse a péptidos y proteínas N-glicosilados con una amplia variedad de N-glicoformas, incluyendo las de alto contenido en manosa, complejas e híbridas, así como fucosiladas y no fucosiladas, sialiladas y no sialiladas, con estructuras bi-, tri- y tetraantenarias. También se une a glicoformas no maduras como la paucimanosa y aquellas con manosa-6-fosfato. Sin embargo, no se une a los N-glicanos con GlcNAc bisectante. P: ¿Qué tan fuerte se une la proteína de unión a N-glicopéptidos a un glicopéptido? R: Según este estudio: Chen 20171, la Kd entre la proteína de unión a N-glicopéptidos y un sialilglicopéptido modelo está en el rango micromolar o submicromolar. 1. Chen M. et al. (2017). Proteína de unión a carbohidratos Fbs1 de alta afinidad diseñada para la captura selectiva de N-glicanos y N-glicopéptidos. Nat Commun. 23 de mayo;8, 15487. P: ¿Puede la proteína de unión a N-glicopéptidos unirse y enriquecer los glicanos libres? R: Sí, la proteína de unión a N-glicopéptidos puede unirse a los glicanos libres si la GlcNAc en el extremo reductor está en su forma libre, en la que la piranosa y la forma de anillo abierto están en equilibrio. Sin embargo, la estructura de anillo de seis miembros (piranosa) es necesaria para la unión. Los glicanos libres con una estructura de anillo completamente abierto, como los marcados por aminación reductora, no se unirán a la proteína de unión a N-glicopéptidos. Los glicanos libres con marcas instantáneas (p. ej., la marca Waters GlycoWorks RapiFluor-MS) no se unirán a la proteína de unión a N-glicopéptidos. No se requiere una asparagina unida al glicano libre para la unión, ni ninguna secuencia peptídica. P: ¿Puede la proteína de unión a N-glicopéptidos unirse a una glicoproteína intacta? R: Sí, la proteína de unión a N-glicopéptidos puede unirse a glicoproteínas intactas. Sin embargo, la unión entre la proteína de unión a N-glicopéptidos y una glicoproteína intacta se ve afectada por la estructura de orden superior de la proteína, la localidad y la estructura de los glicanos. Como resultado, aunque es posible enriquecer glicoproteínas intactas utilizando esta proteína de unión (en un formato inmovilizado, pero no en un flujo de trabajo basado en filtración), la efectividad del pulldown dependerá de la glicoproteína. P: ¿Qué influye en la afinidad de unión de la proteína de unión a N-glicopéptidos? R: Además del requisito de la estructura del glicano de piranosa, varios factores pueden afectar la afinidad de unión de esta proteína con sus sustratos. Un pH más bajo provocará una menor unión; el pH óptimo es de 7,0 a 8,5. La concentración de sal no afecta apreciablemente la unión. Se deben evitar los desnaturalizantes y surfactantes.
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