New England Biolabs, P6042S, Fetuina

La fetuina es una glicoproteína que contiene glicanos sialilados N-ligados y O-ligados que se pueden usar como control positivo para enzimas endoglicosidasas que escinden carbohidratos tanto N-ligados como O-ligados. Categorías relacionadas Sustratos de glicoproteína Aplicaciones Sistemas de expresión,, Secuenciación de glicanos,, Expresión de glicoproteínas recombinantes, Especificación Tampón de almacenamiento 1X Milli-Q agua Peso molecular Aparente: 48,4 kDa Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es un buen sustrato de control de endoglicosidasa? R: Para la O-glucosidasa (NEB# P0733) y la mezcla de desglicosilación de proteínas (NEB# P6039S), sugerimos fetuina (NEB# P6042). Para la PNGasa F (NEB n.° P0704, P0705, P0706), sugerimos la ARNasa B (NEB n.° P7817S) o la fetuina (NEB n.° P6042). P: ¿Por qué la fetuina es un buen sustrato de control tanto para la O-glicosidasa, la PNGasa F como para la mezcla de desglicosilación de proteínas? R: La fetuina es una glicoproteína que contiene glicanos sialilados, tanto N-ligados como O-ligados, y puede analizarse mediante análisis de desplazamiento en gel SDS-PAGE, espectrometría de masas u otros métodos. P: ¿Cuál es la condición típica de una reacción de desglicosilación de fetuina? R: Combine 2 μl de fetuina, 1 μl de tampón desnaturalizante de glicoproteínas 10X y 5 μl de H₂O. Incube a 95 °C durante 10 minutos. Añadir 1 μl de GlycoBuffer 2 10X y 1 μl de NP-40 al 10 %. Añadir 1 μl de endoglicosidasa. Incubar a 37 °C durante 1 hora. Visualizar los productos de reacción en un gel SDS-PAGE al 10-20 %. P: ¿Inhiben los detergentes las exoglicosidasas/endoglucosidasas? R: A niveles moderados (0,5-1,0 % de detergentes iónicos y no iónicos), la mayoría de las glicosidasas muestran una actividad satisfactoria o no se ven afectadas. Las excepciones son: PNGasa F (todas las formulaciones), O-glicosidasa y β-N-acetilglucosaminidasa, que son inhibidas por SDS. Es imperativo añadir NP-40 a una concentración final del 1 % a la mezcla de reacción para contrarrestar la inhibición del detergente. La endoglucosidasa D también es inhibida por SDS; sin embargo, NP-40 no contrarresta esta inhibición. Finalmente, los reactivos estabilizadores comunes como Tween, Triton X-100, NP-40, octil glucósido y sulfobetaínas no detergentes, así como trazas de disolventes orgánicos, pueden impedir una desglicosilación rápida óptima mediante Rapid PNGase F. P: ¿Cuánta endoglicosidasa debo usar para desglicosilar la fetuína en condiciones nativas? R: Cuando la fetuína no se desnaturaliza, la endoglicosidasa puede tener más dificultades para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). Una enzima adicional y tiempos de incubación más prolongados serán útiles, pero estos valores son específicos de cada proteína y deben determinarse empíricamente.