New England Biolabs, P6044S, Mezcla de desglicosilación de proteínas II

La mezcla de desglicosilación de proteínas II contiene todas las enzimas, reactivos y controles para eliminar todos los glicanos N-ligados, así como muchos glicanos O-ligados comunes, de las glicoproteínas. Después de la reacción de desglicosilación, las muestras están listas para ser preparadas para el análisis de espectrometría de masas . Categorías relacionadas Exoglucosidasas, Endoglicosidasas, Análisis del proteoma Aplicaciones Sistemas de expresión, Secuenciación de glicanos, Digestión de proteínas, Especificación Tampón de almacenamiento 50 mM NaCl 20 mM Tris-HCl 2,6 mM EDTA pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre la mezcla descontinuada de desglicosilación de proteínas (NEB n.º P6039) y la nueva mezcla de desglicosilación de proteínas II (NEB n.º P6044)? R: La Mezcla de Desglicosilación de Proteínas II (NEB# P6044) es una reformulación nueva y mejorada de la Mezcla de Desglicosilación de Proteínas (P6039), recientemente descontinuada. Esta Mezcla ahora está compuesta por cinco enzimas recombinantes de alta pureza, optimizadas para la desglicosilación simultánea de glicanos N- y O-ligados. El cambio de formulación exacto entre los dos productos se muestra en la siguiente tabla: Mezcla de desglicosilación de proteínas (P6039) discontinuada Mezcla de desglicosilación de proteínas II (P6044) PNGasa F (sin glicerol) (P0705) PNGasa F (sin glicerol), recombinante (P0709) O-glicosidasa (P0733) O-glicosidasa (P0733) α2-3,6,8 neuraminidasa (P0720) α2-3,6,8,9 neuraminidasa A (P0722) β1-4 galactosidasa (P0730) β1-4 galactosidasa S (P0745) β-N-acetilglucosaminidasa (P0732) β-N-acetilhexosaminidasef (P0721) P: La mezcla de desglicosilación de proteínas II incluye dos tampones de reacción diferentes (10X Deglycosylation Mix Buffer 1 y 2). ¿Cómo sé cuál usar? R: El tampón 1 de la mezcla de desglicosilación 10X (B6044S) debe usarse cuando se requieren condiciones nativas (no desnaturalizantes). El tampón 1 de la mezcla de desglicosilación 10X contiene fosfato de sodio 500 mM, pH 7,5. Este tampón es suave y no contiene agentes desnaturalizantes ni reductores. En este sistema de tampón, la glicoproteína se mantiene 100 % intacta. Sin embargo, la desglicosilación en condiciones nativas suele requerir un exceso de enzima y tiempos de incubación más prolongados, y en algunos casos la eliminación de glicanos no es completa. Por lo tanto, cuando la desnaturalización es aceptable, recomendamos usar el tampón 2 de la mezcla de desglicosilación 10X (B6045S). Este tampón reducirá la glicoproteína, pero también proporcionará el nivel más eficiente y completo de desglicosilación. El tampón 2 de la mezcla de desglicosilación 10X es compatible con la espectrometría de masas y no contiene SDS. Consulte la pestaña "Protocolos y manuales" para conocer el protocolo específico asociado a cada sistema de tampón. P: ¿Son compatibles los análisis posteriores, como la HPLC y la espectrometría de masas, con la mezcla de desglicosilación de proteínas II? R: Sí, todos los reactivos incluidos en la mezcla de desglicosilación de proteínas II son compatibles con las aplicaciones de HPLC y espectrometría de masas. Para preparar muestras para cromatografía líquida o espectrometría de masas, la proteína diana se puede preparar mediante microdiálisis o microfiltración (consulte "Glicoproteómica: Protocolos de intercambio de tampón"). P: Probé la mezcla de desglicosilación de proteínas II en mi glicoproteína y no observé la eliminación del carbohidrato. ¿Cuál podría ser el problema? R: La mezcla de desglicosilación de proteínas II incluye las enzimas necesarias para eliminar los carbohidratos unidos a residuos de asparagina, los carbohidratos simples con enlaces de O en los núcleos 1 y 3 unidos a Ser/Thr, y los O-glicanos decorados en los núcleos 1 y 3 (con extensiones de lactosamina). Existe la posibilidad de que el carbohidrato sea resistente a la PNGasa F (un caso poco frecuente). Esto ocurre cuando la N-acetilglucosamina del núcleo se modifica con una α1-3-fucosa (frecuente en proteínas de plantas o insectos). Además, los O-glicanos extendidos con fucosa, α-galactosa y otros residuos serán resistentes a esta combinación, a menos que se añadan enzimas exoglicosidasas adicionales. Si es posible, utilice el tampón 2 de la mezcla de desglicosilación 10X para reducir la proteína antes de la desglicosilación (este tampón es compatible con la preparación de muestras para espectrometría de masas). La estructura secundaria y terciaria de las proteínas puede impedir que las endoglicosidasas alcancen su sustrato, lo que hace que la reducción sea un paso crucial para una escisión eficiente. Si no desea reducir, considere agregar más enzima y usar tiempos de incubación más largos. La muestra en sí misma podría causar la inactivación de la enzima. Evite los tampones de muestra que contengan SDS, ya que este detergente inhibe la PNGasa F, la O-glicosidasa y la β1-4-galactosidasa. La muestra también podría causar una caída (o aumento) en el pH, particularmente si se utilizan grandes volúmenes (en esos casos, sería ideal intercambiar la muestra en un tampón neutro de baja molaridad). Confirme que su proteína objetivo debe estar glicosilada. Algunos predictores de glicosilación pueden anotar sitios que no están ocupados en la naturaleza. Además, los patrones de glicosilación cambian entre diferentes tejidos, organismos y/o etapas de crecimiento. Del mismo modo, diferentes sistemas de expresión pueden dar lugar a proteínas con cambios inesperados en la glicosilación. Finalmente, el cambio en la movilidad de la proteína (SDS-PAGE, Western blot) puede ser difícil de visualizar (particularmente cuando se ha eliminado un carbohidrato pequeño de una proteína grande). Si es posible, analice controles negativos en paralelo. Optimice las condiciones de carga y procesamiento para facilitar la detección de cambios sutiles de masa. P: ¿Cuánta mezcla de desglicosilación de proteínas II debo usar para eliminar los carbohidratos en condiciones nativas (no desnaturalizantes)? R: Cuando la proteína no se reduce ni se desnaturaliza, la mezcla de desglicosilación de proteínas II puede tener más dificultades para alcanzar el sitio de escisión del carbohidrato (debido a la estructura secundaria y terciaria de la proteína). En condiciones reductoras, recomendamos usar 5 μL de mezcla de desglicosilación por cada 100 μg de proteína. En condiciones nativas, se recomienda usar mezcla de desglicosilación adicional y tiempos de incubación más largos. Algunas proteínas complejas pueden resultar solo parcialmente desglicosiladas en condiciones nativas, incluso después de incubaciones prolongadas. La cantidad exacta de mezcla de desglicosilación necesaria puede depender del nivel de complejidad de cada proteína y debe determinarse empíricamente. P: ¿Cuál es un buen sustrato de control para la mezcla de desglicosilación de proteínas II? R: Sugerimos fetuina (NEB# P6042), ya que es una glicoproteína que contiene glicanos sialilados, enlazados a N y a O. Se suministra un vial de 500 μg de fetuina con la mezcla de desglicosilación de proteínas II. P: ¿Se pueden usar inhibidores de proteasas en la reacción de la mezcla de desglicosilación de proteínas II? R: Cuando una proteína se reduce o desnaturaliza, es más susceptible a la escisión por proteasas. Por esta razón, se puede usar un cóctel de proteasas con los siguientes ingredientes con el protocolo Protein Deglycosylation Mix II: Aprotinina (concentración final de 10 μg/ml), Benzamidina (concentración final de 1 mM), Pepstatina (concentración final de 10 μg/ml), Leupeptina (concentración final de 1 μM), EGTA (concentración final de 1 mM), EDTA (concentración final de 1 mM), PMSF (concentración final de 1 mM). Prepare una solución madre concentrada 1000X de cada inhibidor en agua; excepto la Pepstatina, que debe disolverse en metanol. Nota: El PMSF tiene la capacidad de modificar residuos básicos en sustratos de glicoproteína.