New England Biolabs, P8101S, Trypsin-ultra™, grado de espectrometría de masas

La tripsina-ultra, de grado para espectrometría de masas, es una serina endopeptidasa que escinde selectivamente los enlaces peptídicos C-terminales de los residuos de lisina y arginina. La tripsina-ultra escinde los enlaces Lys-Pro y Arg-Pro a una velocidad mucho menor que cuando Lys y Arg se encuentran en el extremo N-terminal de otros residuos. Categorías relacionadas Proteasas,, Análisis del proteoma Aplicaciones Glicómica y glicoproteómica,, Bioterapéutica y análisis de anticuerpos,, Digestión de proteínas Especificación Condiciones de reacción 1X Tripsina-ultra, tampón de reacción Incubar a 37 °C 1X Tripsina-ultra, tampón de reacción 50 mM Tris-HCl 20 mM CaCl2 (pH 8 a 25 °C) Concentración de uso 100 ng/μl Peso molecular Teórico: 23675 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Existe un tampón compatible para digerir con tripsina (P8101S) y endoproteinasa GluC (P8100S) juntas? R: Sugerimos una mezcla 50:50 del tampón de cada enzima. GluC funciona a máxima actividad con un dipéptido de ácido glutámico estimulante en la reacción. El cloruro de calcio reduce la autólisis de la tripsina. Ambos tampones tienen una cadena principal de Tris-HCl a pH 8. Hemos realizado nuestras digestiones de GluC/Tripsina de esta manera con incubación durante la noche a 37 °C. Ninguna enzima se inhibe por la mezcla del tampón, pero, por supuesto, se digieren mutuamente hasta cierto punto. P: Tengo una concentración muy baja de proteína y preferiría no desnaturalizar como un paso separado con intercambio de tampón antes de la digestión. ¿Qué desnaturalizantes puedo usar en la reacción de tripsina? R: La tripsina no tolera SDS, pero sí tolera niveles bajos (>0,01 %) de la mayoría de los detergentes no iónicos. También debería funcionar calentar la proteína a 95 °C durante 1 minuto (si la proteína permanece soluble al calentarla) o ponerla en urea o guanidinio, no más de 0,25 M para cualquiera de los dos, o desnaturalizará la propia tripsina. P: Me gustaría usar tripsina para digerir algunas proteínas presentes en un sobrenadante de cultivo celular. El sobrenadante está compuesto de DMEM suplementado con 0,2% de BSA y antibióticos. ¿Funcionará la enzima en el sobrenadante celular? El volumen final de reacción será de 100-300 ul. R: La tripsina funcionará en nuestro tampón incluido, pero se puede realizar una digestión en casi cualquier base de tampón (siempre que no haya inhibidores de serina proteasa presentes) ajustando el pH a 8-8,5 y añadiendo CaCl2 a 10 mM. El calcio previene la autólisis de la enzima. Otras concentraciones de sal no suelen ser un problema. Generalmente usamos la tripsina en una proporción de 1:20 a 1:100 enzima:proteína, por lo que necesita una concentración aproximada de proteína que podría determinarse mediante SDS PAGE o un ensayo de proteína con colorante Bradford. Si la BSA al 0,2% es la mayor parte de la proteína, esto sería 2 mg/ml o 200 ug/100 ul y requeriría alrededor de 2 a 10 ug de tripsina. P: Estoy usando tripsina y me pregunto sobre su especificidad. ¿Se corta en sitios adicionales cuando está en alta concentración? R: No. P: Quiero saber si el calcio puede omitirse del tampón, ya que está causando la precipitación de mi complejo ADN-proteína. R: La tripsina se autoproteoliza a menos que haya Ca presente. P: Quiero usar tripsina en 20 µg de proteína. ¿Cuánta enzima necesito usar? R: Normalmente hemos recomendado una proporción en peso de sustrato a tripsina de 20:1; por lo tanto, en este caso, agregue 10 µl de solución madre de tripsina de 100 ng/µl. Para proteómica y aplicaciones a gran escala, usamos regularmente una proporción de 50:1. Algunos experimentadores usan proporciones de hasta 100:1 para limitar los fragmentos de tripsina como contaminantes en el análisis. Se debe tener cuidado al usar bajas cantidades de tripsina para obtener una digestión completa. Una proporción de 10:1 de muestra:Tryspin sería la cantidad máxima de tripsina que se debe utilizar. P: ¿Cómo se realiza una digestión con tripsina en gel? R: Utilice el tampón de digestión con tripsina para volver a hinchar el corte de gel después de deshidratarlo con acetonitrilo. Luego, añada una cantidad de tripsina a la muestra en una proporción de 1:10-20 p/p enzima:sustrato. Por ejemplo, una banda de proteína estimada en 1 µg se combinaría con 50 a 100 ng de tripsina y se incubaría a 25-37 °C durante la noche. Generalmente, limpiamos nuestras reacciones en gel con ZipTips C18 antes de la MS (MALDI-MS o Ion Trap MS/MS). P: ¿Existe una forma sencilla de eliminar la tripsina después de la escisión de proteínas? R: La bezamidina sefarosa (pH 8) eliminará la tripsina intacta, aunque algunos de los péptidos deseados pueden perderse en el proceso. La mejor estrategia es mantener alta la relación de sustrato a tripsina, por ejemplo 50-100:1.